주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석
Summary
여기, 우리는 무대와 초파리 종에서 후 각 조직 개발 해 부 프로토콜을 제시. 있으 나 해 부 조직 immunohistochemistry 또는 제자리에서 같은 비보에 분석 뿐만 아니라 양적 RT-PCR (반전 전사-연쇄 반응) 또는 시퀀싱 (RNAseq), RNA와 같은 분자 분석에 대 한 나중에 사용할 수 있습니다. 교 잡입니다.
Abstract
초파리 의 후 각 시스템 발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동과 행동 진화에 널리 사용 되는 시스템이입니다. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경 이외에 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 프로토콜에서 우리는 성인 초파리 종의 주변 후 각 조직 개발의 해 부를 설명 합니다. 우리는 처음 무대 초파리 애벌레, 중순에 번데기 단계와 성인에서 안테나의 해 부에 의해 따라 초기 번데기 단계에서 더듬이 디스크의 해 부를 이어서 나이 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 어디 준비 qRT-PCR, RNAseq, 또는 immunohistochemistry RNA 추출 등 분자 기법에 활용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 적용할 수 있습니다 또한 다른 초파리 종 종의 번데기 개발 시간, 결정 하 고 각 단계는 적절 한 노화에 대 한 계산 됩니다.
Introduction
발달 신경 생물학, 시스템 신경 과학으로 신경 생리학, 행동 연구, 그리고 행동 진화1,2,3, 초파리 의 후 각 시스템은 널리 사용 되는 시스템 4. 초파리 의 후 각 조직 집 수압 및 온도 감각 신경1,,56외 휘발성 화학 신호를 감지 하는 후 각 수용 체 신경 (ORNs). 이 원고의 전반적인 목표는 무대 초파리 종의 번데기 및 성인 후 각 조직 개발 해 부 하는 방법을 보여 줍니다. 이 기술에 대 한 근거 또한 vivo에서 조직 기술 라벨 샘플 RNAseq 등 정량적 RT-PCR, 주변 후 각 시스템의 분자 및 발달 분석에 대 한 다른 번데기 단계에서 생성 하는 . 이 기술은 특정 세포 유형에 대 한 모든 유전자 변형 시 약 하지 않은 비-초파리 melanogaster 종 개발 성인 후 각 시스템에 transcriptional 프로필의 역학을 식별 하기 위해 특히 유용할 수 있습니다. 표시 하 고 분석입니다. 이 원고, 더듬이 디스크와 번데기 및 성인 초파리 종에서 안테나를 해 부하는 방법을 보여 줍니다. 첫째, 우리 개발 준비 및 종의 노화에 대 한 puparium 형성 (APF, 흰색 pupae 또는 prepupae)의 0 h 초파리 를 식별 하는 방법을 보여 줍니다. 다음, 우리에 게 보여 더듬이 디스크와 제 3 더듬이 세그먼트; 해 부 특히, 눈 디스크 및 RNAseq 또는 RT PCRs에 필요한 조직 순도 대 한 두 번째 더듬이 세그먼트에서 그들을 분리 하는 방법. 미리 무늬 더듬이 디스크 (prepupae)에 해당 하는 단계 D. melanogaster 약이 프로토콜에서 설명에서 일어나는 더듬이에서 선택 디스크 (8 h APF), ORNs (40 h APF)에 대 한 터미널 차별화의 시작 하 고 성인 안테나입니다. 마지막으로, 우리 성인 안테나 메서드를 사용 하 여 고립에서 그리고 vivo에서 immunohistochemistry 양적 RT-PCR에 대 한 예제는 줄. 이 메서드는 RNA/DNA 분석 및 immunohistochemistry 초파리 종에서 주변 후 각 조직 개발에 대 한 샘플을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 실험실 초파리 에 걸쳐이 프로그램의 비교 분석으로 초파리 의 후 각 조직 개발에서 유전과 transcriptional 프로그램을 식별 하는 데 관심이 대 한 유용한 리소스 종입니다. 다른 발달 단계에서 시스템 수준 transcriptional 프로필 미래 연구를 위한 뇌관으로 필요한 경우 특히 유용 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 단계 및 개발에 사용 될 터미널 차별화를 모방 하는 사전에서…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 즐겼다 C. 볼 칸 (뎁-1457690)에 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
Riferimenti
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