Preparación de desarrollar tejido olfatorio periférico para Molecular y el análisis de Immunohistochemical en Drosophila
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la etapa y diseccionar desarrollar tejido olfativo de especies de Drosophila . El tejido disecado más adelante puede ser utilizado para análisis moleculares como RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa) o RNA, secuenciación (RNAseq), así como análisis en vivo como inmunohistoquímica o en situ hibridación.
Abstract
El sistema olfativo de la Drosophila es un sistema ampliamente utilizado en Neurobiología del desarrollo, neurociencia de sistemas, así como Neurofisiología, comportamiento y evolución conductual. Tejidos olfativos de Drosophila casa las neuronas receptoras olfatorias (ORNs) que detectan señales químicas volátiles además de hidro y termo-sensorial neuronas. En este protocolo, se describe la disección de desarrollar tejido olfatorio periférico de la especie Drosophila adulta. En primer lugar describimos cómo la etapa y edad de las larvas de Drosophila , seguidas por la disección del disco antenal de primeras etapas pupas, seguidas de la disección de las antenas de adultos y etapas de pupal mediados. También mostramos los métodos donde se pueden utilizar preparados en técnicas moleculares, como la extracción de RNA para qRT-PCR, RNAseq o inmunohistoquímica. Estos métodos pueden aplicarse también a otras especies de Drosophila después de tiempos de desarrollo pupal específicos se determinan, y etapas respectivas se calculan para el envejecimiento adecuado.
Introduction
El sistema olfativo de la Drosophila es un sistema ampliamente utilizado en Neurobiología del desarrollo, neurociencia de sistemas, así como Neurofisiología, estudios de comportamiento y evolución conductual1,2,3, 4. Las neuronas receptoras olfatorias (ORNs) que detectan señales químicas volátiles además de hidro y termo-sensorial neuronas1,5,6la casa tejidos olfativos de Drosophila . El objetivo general de este manuscrito es demostrar cómo la etapa y diseccionar el desarrollo pupal y adulto tejido olfativo en especies de Drosophila . El fundamento de esta técnica es generar muestras de diferentes etapas de pupal para análisis moleculares y del desarrollo del sistema olfativo periférico, tales como RNAseq y RT-PCR cuantitativa, además en vivo tejido etiquetado técnicas . Esta técnica puede ser especialmente útil para identificar la dinámica de perfiles transcripcionales en el sistema olfatorio adulto en desarrollo de no –melanogaster Drosophila especie, que no tiene todos los reactivos transgénicos para tipo celular específico etiquetado y análisis. En este manuscrito, demostramos cómo diseccionar discos antenales y antenas de especies de Drosophila pupas y adulto. En primer lugar, mostramos cómo identificar Drosophila 0 h de formación del pupario (APF y prepupas y pupas blanco) para la puesta en escena del desarrollo y el envejecimiento propios de cada especie. A continuación, te mostramos cómo diseccionar discos antenales y el tercer segmento antenal; en concreto, cómo disociar del disco ojo y segundo segmento antenal para la pureza del tejido necesaria para RNAseq o RT-PCR. Las etapas en D. melanogaster se describe en este protocolo aproximadamente corresponden al disco antenal previamente modelado (prepupas), la selección de precursores de la antenal de disco (8 h APF), el inicio de la diferenciación terminal de ORNs (40 h APF), y antena de adultos. Finalmente, damos ejemplos de una RT-PCR cuantitativa de antenas adulto aislados utilizando el método y para en vivo inmunohistoquímica. Este método puede utilizarse para generar muestras para un análisis de ARN/ADN y de inmunohistoquímica en el desarrollo de tejidos periféricos olfativos de diferentes especies de Drosophila .
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo es un recurso útil para los laboratorios interesados en identificar los programas genéticos y transcripcionales de funcionamiento en el desarrollo de tejido olfativo de la Drosophila , así como un análisis comparativo de estos programas a través de Drosophila especies. Es especialmente útil si se necesitan sistemas nivel transcripcionales perfiles de diferentes etapas de desarrollo como una cartilla para futuros estudios. El protocolo descrito aquí muestra cómo la etapa y aislar a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por una beca de la National Science Foundation a Pelin C. Volkan (DEB-1457690).
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
Riferimenti
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