Udarbejdelsen af perifere olfaktoriske væv for at udvikle molekylære og immunhistokemisk analyse i Drosophila
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at iscenesætte og dissekere udvikle olfaktoriske væv fra Drosophila arter. De dissekerede væv kan senere bruges til molekylære analyser, som kvantitativ RT-PCR (Reverse transkription-Polymerase Chain Reaction) eller RNA sekventering (RNAseq), samt i vivo analyser som Immunhistokemi eller i situ hybridisering.
Abstract
Den olfaktoriske system af Drosophila er et udbredt system i udviklingsmæssige neurobiologi, systemer neurovidenskab, såvel som neurofysiologi, adfærd og adfærdsmæssige udvikling. Drosophila olfaktoriske væv hus olfaktoriske receptor neuroner (ORNs), der registrerer flygtige kemiske signaler ud over hydro – og thermo-sensoriske neuroner. I denne protokol beskriver vi dissektion af udvikle perifere olfaktoriske væv voksen Drosophila arter. Vi beskriver først sådan fase og alder Drosophila larver, efterfulgt af dissektion af antennal disken fra puppe vorden, efterfulgt af dissektion af antenner fra midten af puppe faser og voksne. Vi viser også metoder hvor præparater kan udnyttes i molekylære teknikker, såsom RNA udvinding for qRT-PCR, RNAseq eller Immunhistokemi. Disse metoder kan også anvendes på andre Drosophila arter efter artsspecifikke puppe udviklingstider bestemmes, og respektive faser beregnes for passende aldring.
Introduction
Den olfaktoriske system af Drosophila er et udbredt system i udviklingsmæssige neurobiologi, systemer neurovidenskab, såvel som neurofysiologi, opførsel undersøgelser og adfærdsmæssige evolution1,2,3, 4. Drosophila olfaktoriske væv hus olfaktoriske receptor neuroner (ORNs), der registrerer flygtige kemiske signaler ud over hydro – og thermo-sensoriske neuroner1,5,6. Det overordnede mål for dette manuskript er at demonstrere, hvordan man på scenen og dissekere udvikle puppe og voksen olfaktoriske væv i Drosophila arter. Begrundelsen for denne teknik er at generere prøver fra forskellige puppe stadier for molekylær og udviklingsmæssige analyser af de perifere olfaktoriske system, såsom RNAseq og kvantitativ RT-PCR, desuden til i vivo væv mærkning teknikker . Denne teknik kan være særligt nyttigt til at identificere dynamikken i transcriptional profiler i den tredje voksen olfaktoriske system fra ikke –melanogaster Drosophila arter, som ikke har alle de transgene reagenser til celle typespecifikke mærkningsbestemmelserne og analyser. I dette håndskrift viser vi, hvordan dissekere antennal diske og antenner fra puppe og voksen Drosophila arter. Først, viser vi hvordan du identificere Drosophila 0 h af puparium dannelse (APF, hvid pupper eller prepupae) for udviklingsmæssige iscenesættelse og artsspecifikke aldring. Næste, vi viser hvordan man kan dissekere antennal diske og den tredje antennal segment; specifikt, hvordan at adskille dem fra øjet disc og andet antennal segment for væv renhed kræves til RNAseq eller RT-PCR’er. Faser i D. melanogaster beskrevet i denne protokol nogenlunde svarer til den pre mønstrede antennal disc (prepupae), udvælgelse af prækursorer fra den antennal disk (8 h APF), starten på den terminal differentiering til ORNs (40 h APF), og voksen antenne. Endelig giver vi eksempler for en kvantitativ RT-PCR fra voksen antenner isoleret ved hjælp af metoden, og for i vivo Immunhistokemi. Denne metode kan bruges til at generere prøver for en RNA/DNA analyse og Immunhistokemi på udvikle perifere olfaktoriske væv fra forskellige Drosophila arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol er en nyttig ressource for labs interesseret i at identificere de genetiske og transcriptional programmer opererer i udvikle Drosophila olfaktoriske væv, samt en sammenlignende analyse af disse programmer på tværs af Drosophila arter. Det er især nyttigt, hvis systemer-niveau transcriptional profiler fra forskellige udviklingsstadier er nødvendig som en primer for fremtidige undersøgelser. Protokollen beskrevet her demonstrerer, hvordan man på scenen og isolere udvikle olfaktoriske…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra National Science Foundation til Pelin C. Volkan (DEB-1457690).
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
Riferimenti
- Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
- Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).
- Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
- Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
- Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
- Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).
- Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
- Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).
- Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).
- Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
- Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).
