Voorbereiding van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel voor moleculaire en analyse van Immunohistochemical in Drosophila
Summary
Hier presenteren we een protocol om te stagen en ontleden olfactorische weefsel van Drosophila diersoorten te ontwikkelen. Het ontleed weefsel kan later worden gebruikt voor moleculaire analyses, zoals kwantitatieve RT-PCR (Reverse transcriptie-Polymerase Chain Reaction) of RNA sequencing (RNAseq), evenals in vivo analyses uitgevoerd, zoals immunohistochemistry of in situ hybridisatie.
Abstract
De olfactorische systeem van Drosophila is een veelgebruikt systeem in developmental neurobiologie, systemen neurowetenschappen, evenals neurofysiologie, gedrag en gedrags evolutie. Drosophila olfactorische weefsels huis de olfactorische receptor neuronen (ORNs), die vluchtige chemische signalen naast hydro – en thermo-sensoriële neuronen detecteren. In dit protocol beschrijven we de dissectie van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel van de volwassen Drosophila soorten. Eerst beschrijven we hoe stagen en leeftijd Drosophila larven, gevolgd door de dissectie van de antennal schijf van vroege pop stadia, gevolgd door de dissectie van de antennes van medio-pop podia en volwassenen. We tonen ook methoden waar de voorbereidingen in moleculaire technieken, zoals de RNA extractie voor qRT-PCR, RNAseq of immunohistochemistry kunnen worden gebruikt. Deze methoden kunnen ook worden toegepast op andere soorten Drosophila na soortspecifieke pop ontwikkelingstijd worden bepaald, en de respectieve fasen worden berekend voor passende veroudering.
Introduction
De olfactorische systeem van Drosophila is een veelgebruikt systeem in developmental neurobiologie, systemen neurowetenschappen, evenals neurofysiologie, gedrag studies en gedrags evolutie1,2,3, 4. Drosophila olfactorische weefsels huis de olfactorische receptor neuronen (ORNs) die vluchtige chemische signalen naast hydro – en thermo-sensorische neuronen1,5,6te detecteren. Het algemene doel van dit manuscript is om aan te tonen hoe te stagen en ontleden ontwikkelen van pop en volwassen olfactorische weefsel in Drosophila soorten. De reden voor deze techniek is het genereren van monsters van verschillende pop stadia voor moleculaire en developmental analyses van de perifere olfactorische systeem, zoals RNAseq en kwantitatieve RT-PCR, daarnaast aan in vivo weefsel labeling technieken . Deze techniek kunnen vooral nuttig zijn om te identificeren dynamiek van transcriptionele profielen in de ontwikkelingslanden volwassen olfactorische systeem van niet –Drosophila melanogaster soorten, die niet over alle transgene reagentia voor celtype specifieke beschikken labelen en analyses. In dit manuscript, laten we zien hoe te ontleden antennal schijven en antennes van pop en volwassen Drosophila diersoorten. Eerst laten we zien hoe te identificeren Drosophila 0 h van de puparium formatie (APF, witte poppen of prepupae) voor ontwikkelingsstoornissen fasering en soortspecifieke veroudering. Vervolgens laten we zien hoe ontleden antennal schijven en het derde antennal segment; in het bijzonder hoe hen te distantiëren van de oog-schijf en tweede antennal segment voor de zuiverheid van de weefsel vereist voor RNAseq of RT-PCRs. De stadia in D. melanogaster beschreven in dit protocol ongeveer overeenkomen met de vooraf gedessineerde antennal schijf (prepupae), de selectie van precursoren van de antennal disc (8 h APF), het begin van de terminal differentiatie voor ORNs (40 h APF), en volwassen antenne. Tot slot geven we voorbeelden voor een kwantitatieve RT-PCR van volwassen antennes geïsoleerd met behulp van de methode, en voor in vivo immunohistochemistry. Deze methode kan worden gebruikt voor het genereren van monsters voor een RNA/DNA-analyse en voor immunohistochemistry op de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsels van verschillende soorten van Drosophila .
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is een nuttige bron voor labs geïnteresseerd in het identificeren van de genetische en transcriptionele programma’s actief in het ontwikkelen van Drosophila olfactorische weefsel, evenals een vergelijkende analyse van deze programma’s over Drosophila soorten. Het is vooral nuttig als systemen-niveau transcriptionele profielen uit verschillende ontwikkelingsstadia nodig zijn als een primer voor toekomstige studies. Het protocol beschreven hier laat zien hoe stagen en isoleren olfactorische …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door een subsidie van de National Science Foundation Pelin C. Volkan (DEB-1457690).
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
Riferimenti
- Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
- Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).
- Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
- Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
- Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
- Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).
- Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
- Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).
- Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).
- Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
- Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).
