Vorbereitung, Entwicklung von peripheren olfaktorische Gewebe für Molekulare und immunhistochemische Analysen in Drosophila
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bühne und sezieren, olfaktorische Gewebe von Drosophila -Arten zu entwickeln. Das sezierte Gewebe kann später für Molekulare Analysen, wie quantitative RT-PCR (Reverse Transkription-Polymerase Chain Reaction) oder RNA Sequenzierung (RNAseq), sowie in-Vivo -Analysen wie Immunohistochemistry oder in Situ verwendet werden Hybridisierung.
Abstract
Das olfaktorische System von Drosophila ist ein weit verbreitetes System in Entwicklungsneurobiologie, Systeme Neurowissenschaften sowie Neurophysiologie, Verhalten und Verhaltensstörungen Evolution. Drosophila olfaktorische Gewebe beherbergen die olfaktorischen Rezeptor Neuronen (ORNs), die flüchtigen chemischen Signale neben Hydro und Thermo-sensorischen Neuronen zu erkennen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Zerlegung des peripheren olfaktorische Gewebe von Erwachsenen Drosophila -Arten zu entwickeln. Wir beschreiben zuerst zu inszenieren und Drosophila Larven, gefolgt von der Dissektion der riechzentrum Scheibe aus frühen pupal Stadien, gefolgt von der Dissektion der Antennen ab Mitte pupal Stadien und Erwachsene Alter. Wir zeigen auch Methoden wo Vorbereitungen können Molekulare Techniken, wie die RNA-Extraktion für qRT-PCR, RNAseq oder Immunhistochemie eingesetzt werden. Diese Methoden können auch auf andere Drosophila -Arten angewendet werden, nachdem artspezifische pupal Entwicklungszeiten bestimmt sind und jeweiligen Etappen sind für entsprechende Aging berechnet.
Introduction
Das olfaktorische System der Drosophila ist verbreitetes System in Entwicklungsneurobiologie, Systeme Neurowissenschaften sowie Neurophysiologie Verhalten Studien und Verhaltensstörungen Evolution1,2,3, 4. Drosophila olfaktorische Gewebe beherbergen die olfaktorischen Rezeptor Neuronen (ORNs), die flüchtigen chemischen Signale neben Hydro und Thermo-sensorischen Neuronen1,5,6zu erkennen. Das übergeordnete Ziel dieser Handschrift soll veranschaulichen, wie Bühne und sezieren pupal und Erwachsenen olfaktorische Gewebe in Drosophila -Arten zu entwickeln. Die Gründe für diese Technik ist es, Proben von verschiedenen pupal Stadien für Entwicklungsbiologie und Molekulare Analysen des peripheren olfaktorischen Systems, wie RNAseq und quantitative RT-PCR, zusätzlich zu in Vivo Gewebe Kennzeichnung Techniken erzeugt . Diese Technik ist besonders hilfreich zur Dynamik der transcriptional Profile im entwickelnden Erwachsenen olfaktorischen System von nicht-Drosophila Melanogaster Spezies zu identifizieren, die nicht über die transgenen Reagenzien für Zelltyp spezifische verfügen Kennzeichnung und Analysen. In diesem Manuskript demonstrieren wir riechzentrum Scheiben und Antennen von pupal und Erwachsenen Drosophila -Arten zu sezieren. Zunächst zeigen wir wie Drosophila 0 h der puppenkammer Formation (APF, weißen Puppen oder Prepupae) für Entwicklungsstörungen Inszenierung und artspezifische Alterung zu identifizieren. Als Nächstes zeigen wir wie Sie riechzentrum Scheiben und das dritte riechzentrum Segment zergliedern; speziell, wie man sie von Auge Scheibe und zweite riechzentrum Segment für die Gewebe-Reinheit erforderlich für RNAseq oder RT-PCR zu distanzieren. Die Stadien in D. Melanogaster beschrieben in diesem Protokoll etwa entsprechen die Pre-gemusterten riechzentrum Scheibe (Prepupae), die Auswahl von Vorläufern aus dem riechzentrum disc (8 h APF), Beginn der terminal Differenzierung für ORNs (40 h APF), und Erwachsenen-Antenne. Zu guter Letzt geben wir Beispiele für eine quantitative RT-PCR von Erwachsenen Antennen isoliert mit der Methode und für in Vivo Immunohistochemistry. Diese Methode kann verwendet werden, um Proben für eine RNA/DNA-Analyse und Immunohistochemistry auf die Entwicklung von peripherer olfaktorischer Gewebes von Drosophila -Arten zu generieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ist eine nützliche Ressource für Labs interessiert bei der Identifizierung der genetischen und transkriptionelle Programme bei der Entwicklung von Drosophila olfaktorische Gewebe sowie eine vergleichende Analyse dieser Programme in Drosophila Spezies. Es ist besonders nützlich, wenn Systemebene transcriptional Profile aus verschiedenen Entwicklungsstadien als Grundierung für zukünftige Studien erforderlich sind. Das hier beschriebene Protokoll veranschaulicht zu inszenieren und zu …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch ein Stipendium der National Science Foundation, Pelin C. Volkan (DEB-1457690).
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
Riferimenti
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