הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב ומנתחים לפתח חוש הריח רקמות ממינים דרוזופילה . הרקמה ביתור מאוחר יותר ניתן להשתמש עבור ניתוחים מולקולריים, כגון כמותיים RT-PCR (הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית) או RNA רצף (RNAseq), כמו גם ניתוחים ויוו כגון אימונוהיסטוכימיה או בחיי עיר הכלאה.
Abstract
מערכת הריח של דרוזופילה הוא בשימוש נרחב מערכת הנוירו-ביולוגיה התפתחותית, מערכות neuroscience, כמו גם נוירופיזיולוגיה, התנהגות ו אבולוציה התנהגותית. רקמות חוש הריח דרוזופילה בית הנוירונים קולטני ריח (ORNs) לזהות סימנים כימיים נדיפים בנוסף הידרו – ו התרמו-החישה הניריונים. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הקרע לפתח רקמות היקפיים חוש הריח של המין דרוזופילה למבוגרים. ראשית נתאר כיצד שלב גיל דרוזופילה הזחלים, ואחריה את הקרע של הדיסק antennal הגולמי בשלבים המוקדמים, ואחריה ניתוח מחושיהם שלבים אמצע-הגולמי ומבוגרים. אנו גם מראים שיטות שבו ההכנות יכול להיות מנוצל טכניקות מולקולריות, כגון החילוץ RNA לרביעיית-PCR, RNAseq או אימונוהיסטוכימיה. שיטות אלה ניתן להחיל גם למינים אחרים דרוזופילה לאחר פיתוח הגולמי תלויי מין פעמים נקבעים, בשלבים המתאימים מחושבים להזדקנות המתאים.
Introduction
מערכת הריח של דרוזופילה הוא מערכת הנפוצה הנוירו-ביולוגיה התפתחותית, מערכות neuroscience, כמו גם נוירופיזיולוגיה, לימודי התנהגות ו אבולוציה התנהגותית1,2,3, 4. רקמות חוש הריח דרוזופילה בית הנוירונים קולטני ריח (ORNs) לזהות סימנים כימיים נדיפים בנוסף הידרו – ו התרמו-החישה הניריונים1,5,6. המטרה הכוללת של כתב יד זה הוא כדי להדגים כיצד שלב ומנתחים לפתח רקמות חוש הריח הגולמי ומבוגרים במינים דרוזופילה . הרציונל של טכניקה זו היא כדי ליצור דוגמאות מתוך שלבים שונים הגולמי עבור ניתוחים התפתחותית המולקולריים של מערכת הריח היקפיים, כגון RNAseq ו- RT-PCR כמותי, בנוסף ויוו רקמת תיוג טכניקות . טכניקה זו יכולה להיות שימושית במיוחד לזהות את הדינמיקה של פרופילים תעתיק במערכת בפיתוח חוש הריח למבוגרים מן הלא –melanogaster דרוזופילה מינים, אשר אין כל ריאגנטים הטרנסגניים עבור סוג התא הספציפי תיוג וניתוחים. כתב יד זה, נדגים כיצד לנתח דיסקים antennal ומחושים ממינים דרוזופילה הגולמי ומבוגרים. ראשית, אנו מראים כיצד לזהות דרוזופילה הו היווצרות puparium (APF, גלמים לבנים או prepupae) עבור הזמני התפתחותית והזדקנות ספציפית. בשלב הבא, אנו מציגים כיצד לנתח דיסקים antennal ו- antennal המגזר השלישי; באופן ספציפי, כיצד לבטל אותם מן העין דיסק קטע antennal שני טוהר רקמת RNAseq או RT-מותני. שלבי ד melanogaster שמתואר פרוטוקול זה בערך שיתאימו הדיסק antennal בדוגמת מראש (prepupae), הבחירה של סימנים מקדימים של antennal דיסק (8 שעות APF), ההתחלה של בידול מסוף עבור ORNs (40 h APF), ו אנטנה למבוגרים. בסופו של דבר, אנחנו נותנים דוגמאות עבור RT-PCR כמותי של אנטנות למבוגרים מבודדים בשיטת, ובשביל ויוו אימונוהיסטוכימיה. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי ליצור דוגמאות עבור ניתוח RNA/DNA, אימונוהיסטוכימיה על פיתוח רקמות היקפיים חוש הריח של מינים שונים דרוזופילה .
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הוא משאב שימושי עבור מעבדות מעוניין לזהות את גנטי תעתיק ותוכניות הפעלה בפיתוח דרוזופילה רקמות חוש הריח, כמו גם ניתוח השוואתי של תוכניות אלה על פני דרוזופילה מינים. זה שימושי במיוחד אם מערכות ברמת פרופילים תעתיק של שלבים התפתחותיים שונים נדרשים בתור פריימר עבור מחקרי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק של הקרן הלאומית למדע כדי Pelin ג וולקן (דב-1457690).
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
Riferimenti
- Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
- Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).
- Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
- Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
- Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
- Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).
- Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
- Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).
- Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).
- Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
- Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).
