Preparare lo sviluppo di tessuto periferico olfattivo per molecolare e l'analisi di Immunohistochemical in Drosophila
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per tappa e sezionare lo sviluppo di tessuto olfattivo da specie di Drosophila . Il tessuto dissecato più tardi può essere utilizzato per le analisi molecolari, quali quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) o RNA sequenziamento (RNAseq), così come in vivo analisi quali immunoistochimica o in situ ibridazione.
Abstract
Il sistema olfattivo di Drosophila è un sistema ampiamente usato in neurobiologia inerente allo sviluppo, neuroscienza sistemiche, come pure neurofisiologia, comportamento ed evoluzione del comportamento. Drosophila olfattivi tessuti casa i neuroni olfattivi (ORNs) che rilevano chimici volatili spunti oltre ai neuroni idro-termo-sensoriale. In questo protocollo, descriviamo la dissezione di sviluppare tessuto periferico olfattivo della specie Drosophila adulto. Descriviamo in primo luogo come tappa e larve di Drosophila , seguite da dissezione del disco antennale dalla prime fasi pupal, seguite da dissezione delle antenne da adulti e metà-pupal fasi di età. Mostriamo anche metodi dove preparazioni possono essere utilizzati in tecniche molecolari, come l’estrazione di RNA per qRT-PCR, RNAseq o immunohistochemistry. Questi metodi possono applicarsi anche ad altre specie di Drosophila dopo tempi di sviluppo pupale specie-specifici sono determinati, e rispettivi stadi sono calcolati per invecchiamento appropriato.
Introduction
Il sistema olfattivo di Drosophila è un sistema ampiamente usato in neurobiologia inerente allo sviluppo, neuroscienza sistemiche, come pure neurofisiologia, studi di comportamento e comportamentali evolution1,2,3, 4. Drosophila olfattivi tessuti casa i neuroni olfattivi (ORNs) che rilevano chimici volatili spunti oltre a idro-termo-sensoriale neuroni1,5,6. L’obiettivo generale di questo manoscritto è quello di dimostrare come tappa e sezionare sviluppando pupa e adulto tessuto olfattivo nella specie di Drosophila . La spiegazione razionale per questa tecnica è quello di generare campioni da diverse fasi pupal per analisi molecolari e dello sviluppo del sistema olfattivo periferico, come RNAseq e RT-PCR quantitativa, in aggiunta al tessuto in vivo tecniche di etichettatura . Questa tecnica può essere particolarmente utile per identificare la dinamica dei profili trascrizionali in sviluppo del sistema olfattivo adulto da specie non –melanogaster della drosofila , che non hanno tutti i reagenti transgenici per cella tipo specifico etichettatura e analisi. In questo manoscritto, dimostriamo come dissezionare antennali dischi e antenne dalla specie di Drosophila pupa e adulto. In primo luogo, vi mostriamo come identificare Drosophila 0 h di formazione pupario (APF, pupe bianche o membranose) per la stadiazione inerente allo sviluppo e invecchiamento specie-specifico. Successivamente, vi mostriamo come dissezionare antennali dischi e il terzo segmento antennale; in particolare, come li dissociare dal disco di occhio e secondo segmento antennale per la purezza di tessuto necessaria per RNAseq o RT-PCR. Le fasi in d. melanogaster descritti nel presente protocollo all’incirca corrispondono al disco antennale pre-modellato (membranose), la selezione dei precursori dalle antenne a disco (8h APF), l’inizio della differenziazione terminale per ORNs (40h APF), e adulto dell’antenna. Infine, diamo esempi per una RT-PCR quantitativa da adulte Antenne isolate utilizzando il metodo e per l’immunoistochimica in vivo . Questo metodo può essere utilizzato per generare i campioni per l’analisi di RNA/DNA e immunohistochemistry sullo sviluppo di tessuti periferici olfattivi da diverse specie di Drosophila .
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è una risorsa utile per i laboratori interessati a individuare i programmi genetici e trascrizionali operanti nello sviluppo di tessuto olfattivo Drosophila , nonché un’analisi comparativa di questi programmi in Drosophila specie. È particolarmente utile se il livello dei sistemi profili trascrizionali da diversi stadi di sviluppo sono necessari come primer per gli studi futuri. Il protocollo descritto qui di seguito viene illustrato come tappa e isolare lo sviluppo di tessuto olfat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione della National Science Foundation di Pelin C. Volkan (DEB-1457690).
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
Riferimenti
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