周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析
Summary
ここでは、ステージし、解剖ショウジョウバエ種から嗅覚の組織を開発するためのプロトコルを提案する.解剖組織は、免疫組織化学または上皮内などの生体内解析だけでなく、定量的 RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応) や RNA 配列 (RNAseq) などの分子生物学的解析の後で使用できます。交配。
Abstract
ショウジョウバエの嗅覚は発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動、行動の進化で広く使われているシステムです。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロンに加え揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。このプロトコルでは大人のショウジョウバエ種の嗅覚の末梢組織の開発の解剖について述べる。最初にステージングして、半ば蛹と大人からアンテナの解剖によって続いて蛹初期から続く、触角の解剖によってショウジョウバエ幼虫の年齢方法について述べる。我々 も準備を qRT PCR、RNAseq、または免疫組織化学の RNA の抽出など、分子生物学の手法で活用できるメソッドに示します。これらのメソッドは、種特異的な蛹の発育度の決定、および適切な高齢化の各段階の計算後、他のショウジョウバエの種に適用もできます。
Introduction
発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動学、行動の進化1,2,3、ショウジョウバエの嗅覚システムは広く使用されているシステム 4。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロン1,5,6に加えて揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。この原稿の全体的な目標は、ステージおよびショウジョウバエ種の蛹と大人の嗅覚組織の開発を分析する方法を示すことです。この技術のための理論的根拠は体内組織ラベリング技術にさらに RNAseq、定量的 RT-PCR など、周辺の嗅覚システムの分子・発達的分析に蛹の段階からサンプルを生成するには.この手法は、特定型のセルのすべての遺伝子導入試薬を持っていない非キイロショウジョウバエ ショウジョウバエの種から開発大人嗅覚システムの転写プロファイルのダイナミクスを識別する特に役立ちますラベリングと分析。本稿では、触角のディスクと蛹と大人のショウジョウバエ種からアンテナを分析する方法を示します。まず、ショウジョウバエの蛹殻形成過程 (APF、白い蛹や前蛹) 発達のステージングと種特異的な高齢化のための 0 h を識別する方法を示します。次に、触角ディスクと 3 番目の触角セグメントを分析する方法を示す具体的には、目のディスクと RNAseq または RT-Pcr に必要な組織の純度の第 2 触角セグメントからそれらを分離する方法。キイロショウジョウバエ約このプロトコルで記述されている段階対応済みパターンの触角 (前蛹)、前駆体、触角からの選択ディスク (8 h APF) ORNs (40 h APF) の分化の開始とアダルト アンテナ。メソッドを使用して分離された大人アンテナからと生体内での免疫組織化学の最後に、我々 は、定量的 RT-PCR 法の例を与えます。このメソッドは、RNA ・ DNA 分析、ショウジョウバエ種から末梢の嗅覚組織の開発に免疫組織化学のサンプルを生成する使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この議定書は遺伝子と転写プログラム開発ショウジョウバエ嗅覚組織だけでなく、これらのプログラムの比較分析ショウジョウバエで動作を識別するのに興味を持って実験室のための有用なリソース種。それは、将来の研究のためのプライマーとしてさまざまな発達段階からシステム レベルの転写プロファイルが必要な場合に便利です。ここで説明されているプロトコルはステ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、ペリン C. ボルカン (デブ 1457690) に全米科学財団からの助成金によって支えられました。
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
Riferimenti
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