Forbereder utvikle perifere Olfactory vev for molekylær og Immunohistochemical analyse i Drosophila
Summary
Her presenterer vi en protokoll for scenen og dissekere utvikle olfactory vev fra Drosophila arter. Dissekert vevet kan senere brukes til molekylær analyser, som kvantitative RT PCR (omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjons) eller RNA sekvensering (RNAseq), samt i vivo analyser som immunohistochemistry eller i situ hybridisering.
Abstract
Olfactory systemet Drosophila er en mye brukt system i utviklingsmessige nevrobiologi, systemer nevrovitenskap, samt nevrofysiologi, atferd og opptreden utviklingen. Drosophila olfactory vev huset olfactory reseptor neurons (ORNs) oppdage flyktige kjemiske signaler i tillegg til hydro – og thermo-sensoriske neurons. I denne protokollen beskriver vi Disseksjon av utvikle perifere olfactory vev av voksen Drosophila arter. Vi først beskrive hvordan scenen og alder Drosophila larvene, etterfulgt av Disseksjon av antennal platen fra tidlig pupal fase, etterfulgt av Disseksjon av antenner fra midt-pupal stadier og voksne. Vi viser også metoder der preparater kan benyttes i molekylær teknikker, som RNA utvinning qRT PCR, RNAseq eller immunohistochemistry. Disse metodene kan også brukes til andre Drosophila arter etter artsspesifikke pupal utvikling ganger fastsettes, og respektive stadier er beregnet for riktig aldring.
Introduction
Olfactory systemet Drosophila er en mye brukt system i utviklingsmessige nevrobiologi, systemer nevrovitenskap, samt nevrofysiologi, atferd studier og atferdsmessige utviklingen1,2,3, 4. Drosophila olfactory vev huset olfactory reseptor neurons (ORNs) oppdage flyktige kjemiske signaler i tillegg til hydro – og thermo-sensoriske neurons1,5,6. Det overordnede målet med dette manuskriptet er å scenen og dissekere utvikle pupal og voksen olfactory vev i Drosophila arter. Begrunnelsen for denne teknikken er å generere prøver fra ulike pupal stadier for molekylær og utviklingsmessige analyser eksterne olfactory systemet, som RNAseq og kvantitative RT PCR, i tillegg til i vivo vev merking teknikker . Denne teknikken kan være spesielt nyttig å identifisere dynamikken i transcriptional profiler i utviklingsland voksen olfactory systemet fra ikke –melanogaster Drosophila arter som ikke har alle celle type bestemt transgene reagensene merking og analyser. I dette manuskriptet viser vi hvordan å analysere antennal plater og antenner fra pupal og voksen Drosophila arter. Først viser vi hvordan du identifiserer Drosophila 0t blodsugende formasjonen (APF, hvit pupae eller prepupae) for utviklingsmessige staging og artsspesifikke aldring. Deretter viser vi hvordan å analysere antennal plater og tredje antennal segmentet; spesielt hvordan å distansere seg fra øye platen og andre antennal segmentet for vev renheten kreves for RNAseq eller RT-PCRene. Stadier i D. melanogaster beskrevet i denne protokollen omtrent tilsvarer pre mønstret antennal platen (prepupae), valg av prekursorer fra den antennal plate (8 h APF), starter terminal differensiering for ORNs (40 h APF), og voksen antenne. Til slutt, vi gir eksempler for en kvantitativ RT PCR fra voksen antenner isolert med metoden og i vivo immunohistochemistry. Denne metoden kan brukes til å generere prøver for en RNA/DNA-analyse og immunohistochemistry på å utvikle perifere olfactory vev fra ulike Drosophila arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen er en nyttig ressurs for labs interessert i å identifisere genetiske og transcriptional programmene i utvikle Drosophila olfactory vev, samt en komparativ analyse av disse programmene over Drosophila arter. Det er spesielt nyttig hvis systemer nivå transcriptional profiler fra forskjellige utviklingsstadier er nødvendig som en primer for framtidige studier. Protokollen beskrevet her demonstrerer hvordan å iscenesette og isolere utvikle olfactory vev fra Drosophila hente pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av et stipend fra National Science Foundation å Pelin C. Volkan (DEB-1457690).
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
Riferimenti
- Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
- Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).
- Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
- Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
- Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
- Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).
- Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
- Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).
- Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).
- Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
- Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).
