Preparando a desenvolver tecido olfativo periférico para Molecular e análise imuno-histoquímica em Drosophila
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para estágio e dissecar a desenvolver o tecido olfativo de espécies de Drosophila . O tecido dissecado mais tarde pode ser usado para análises moleculares, como quantitativa de RT-PCR (Reverse transcrição-Polymerase Chain Reaction) ou RNA sequenciamento (RNAseq), bem como na vivo de análise como a imuno-histoquímica ou em situ hibridização.
Abstract
O sistema olfativo de Drosophila é um sistema amplamente utilizado em neurobiologia do desenvolvimento, neurociência de sistemas, bem como neurofisiologia, comportamento e evolução comportamental. Drosófila olfativos tecidos casa os neurônios olfactory do receptor (ORNs) que detectam sugestões químicas voláteis, além dos neurônios-hidro e thermo-sensorial. Neste protocolo, descrevemos a dissecação de desenvolver tecido olfativo periférico da espécie Drosophila adulto. Primeiro, descrevemos como fase e idade larvas de Drosophila , seguidas pela dissecação do disco da antena de primeiros estágios pupal, seguidos pela dissecação de antenas de adultos e estágios meados-pupal. Mostramos também métodos onde as preparações podem ser utilizadas em técnicas moleculares, tais como a extração de RNA para qRT-PCR, RNAseq ou imuno-histoquímica. Esses métodos também podem ser aplicados a outras espécies de Drosophila , após desenvolvimento pupal espécie-específicos são determinados e respectivas fases são calculados para envelhecimento adequado.
Introduction
O sistema olfativo de Drosophila é um sistema amplamente utilizado em neurobiologia do desenvolvimento, neurociência de sistemas, bem como neurofisiologia, estudos de comportamento e evolução comportamental1,2,3, 4. Drosófila olfativos tecidos casa os neurônios olfactory do receptor (ORNs) que detectam sinais químicos voláteis além de neurônios sensoriais hidro – e thermo1,5,6. O objetivo geral do presente manuscrito é demonstrar como estágio e dissecar desenvolvimento pupal e adulto tecido olfativo em espécies de Drosophila . A justificativa para esta técnica é para gerar amostras de diferentes estágios pupal para análises moleculares e no desenvolvimento do sistema olfativo periférico, tais como RNAseq e RT-PCR quantitativo, além na vivo tecido técnicas de rotulagem . Esta técnica pode ser especialmente útil para identificar a dinâmica do transcriptional perfis no sistema olfativo em desenvolvimento adulto da espécie non –melanogaster da drosófila , que não dispõem de todos os reagentes transgênicos para o tipo de célula específico rotulagem e análises. Neste manuscrito, demonstramos como dissecar discos da antena e antenas de espécies de Drosophila pupa e adultas. Primeiro, mostramos como identificar Drosophila 0 h de formação do casulo (APF, pupas brancas ou pré-pupa) para preparo do desenvolvimento e envelhecimento espécie-específicos. Em seguida, mostramos como dissecar os discos da antena e o terceiro segmento da antena; especificamente, como dissociar o disco do olho e o segundo segmento da antena para a pureza de tecido necessária para RNAseq ou RT-PCR. Os estágios no d. melanogaster descrito neste protocolo aproximadamente correspondem ao disco da antena previamente padronizado (pré-pupa), a seleção de precursores da antena de disco (8 h APF), o início da diferenciação terminal para ORNs (40 h/a APF), e antena de adulta. Finalmente, damos exemplos para um RT-PCR quantitativo de antenas adultas isoladas usando o método e por imuno-histoquímica na vivo . Esse método pode ser usado para gerar amostras para uma análise de DNA/RNA e imuno-histoquímica no desenvolvimento de tecidos periféricos olfativos, de diferentes espécies de Drosophila .
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo é um recurso útil para laboratórios interessados em identificar os programas genéticos e transcriptional operando no desenvolvimento de tecido olfativo de Drosophila , bem como uma análise comparativa destes programas através de Drosophila espécies. É especialmente útil se sistemas-nível transcricionais perfis de diferentes estádios de desenvolvimento são necessários como um primer para futuros estudos. O protocolo descrito aqui demonstra como estágio e isolar a desenvolver …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado por uma concessão do National Science Foundation para Pelin C. Volkan (DEB-1457690).
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
Riferimenti
- Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
- Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).
- Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
- Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
- Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
- Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).
- Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
- Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).
- Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).
- Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
- Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).
