Calorespirometry : Une approche puissante et non invasive pour étudier le métabolisme énergétique cellulaire
Summary
Ce protocole décrit le calorespirometry, la mesure directe et simultanée de dissipation de la chaleur et la respiration, qui fournit une approche non invasive pour évaluer le métabolisme énergétique. Cette technique est utilisée pour évaluer la contribution des voies aérobies et anaérobies à l’utilisation de l’énergie en contrôlant le flux d’énergie cellulaire totale.
Abstract
Plusieurs lignées de cellules utilisées dans la recherche biologique et biomédicale fondamentale maintiennent l’homéostasie énergétique grâce à une combinaison de la respiration aérobique et anaérobique. Toutefois, la mesure dans laquelle les deux voies contribuent au paysage de la production d’énergie cellulaire est systématiquement négligée. Les cellules transformées cultivées en saturant les niveaux de glucose souvent montrent une dépendance réduite sur la phosphorylation oxydative pour la production d’ATP, qui est compensée par une augmentation de la phosphorylation au niveau du substrat. Ce changement dans l’équilibre métabolique permet aux cellules de proliférer malgré la présence de toxines mitochondriales. En négligeant la poise altérée métabolique des cellules transformées, les résultats d’un criblage pharmaceutique peuvent être mal interprétés depuis le potentiellement mitotoxic effets peuvent ne pas être détectés modèle de lignées de cellules cultivées en présence de forte concentration de glucose concentrations. Ce protocole décrit le couplage des deux techniques puissantes, respirométrie et calorimétrie, qui permet l’évaluation quantitative et non invasive des aérobies et anaérobies contributions à la production d’ATP cellulaire. Respiration aérobie et anaérobie génère de la chaleur qui peut être surveillé par calorimétrie. Pendant ce temps, mesurer le taux de consommation d’oxygène peut évaluer l’ampleur de la respiration aérobie. Lorsque la dissipation thermique et consommation d’oxygène sont mesurés en même temps, le ratio de calorespirometric peut être déterminé. La valeur expérimentale obtenue peut alors être comparée à l’équivalent d’oxycaloric théorique et l’étendue de la respiration anaérobie peut être jugée. Ainsi, calorespirometry fournit une méthode unique pour analyser un large éventail de questions biologiques, y compris le développement de médicaments, la croissance microbienne et fondamentaux bioénergétiques normoxique et des conditions d’hypoxie.
Introduction
Dans les systèmes biologiques, le dégagement de chaleur ou enthalpie changement au cours du métabolisme est généralement contrôlé soit directement (via direct calorimétrie) ou indirectement par l’intermédiaire de la consommation de2 O ou la production de CO2 (via respirométrie). Malheureusement, lorsque ces techniques sont utilisées dans l’isolement, information critique est perdue, comme la contribution des voies anaérobies au métabolisme cellulaire. Calorespirometry est une technique puissante qui s’appuie sur la mesure simultanée de dissipation de la chaleur et la respiration. Calorespirometric travail de pionnier étudié le métabolisme anaérobie dans les cellules de mammifères totalement oxygénés et démontré des cotisations simultanées des voies aérobies et anaérobies à l’homéostasie énergétique malgré les cellules transformées en un environnement complètement oxygéné1. Calorespirometry a depuis lors été appliqué à une grande variété de questions biologiques. Voici quelques exemples : l’étude de l’énergétique animale à faibles teneurs en oxygène, les effets des herbicides et œstrogènes sur les branchies de bivalves, le métabolisme des organismes terrestres et la décomposition microbienne des sols organiques question2, 3 , 4 , 5 , 6. par ailleurs, calorespirometry a révélé comment métabolique préconditionnement avant congélation améliore la cryoconservation de mammifères cellules7. Chaque approche, calorimétrie tant respirométrie, a augmenté indépendamment de notre connaissance de bioénergétique cellulaire et organismique. Cependant, des questions biologiques fondamentales auxquelles on peuvent répondre grâce à l’utilisation de calorespirometry demeurent relativement inexplorées.
Loi de Hess déclare que le changement d’enthalpie totale d’une réaction est indépendant de la voie entre les États initiaux et finaux. Par exemple, le changement d’enthalpie totale pour une voie biochimique est la somme de la variation de l’enthalpie de réaction de tous au sein de la voie. Calorimétrie propose une approche en temps réel pour mesurer la production de chaleur cellulaire, qui permet de détecter sans discernement des voies aérobies et anaérobies. Ceci est basé sur le fondement qu’aucune énergie n’est échangée dans le système, sauf à travers les parois de l’ ampoule expérimentales8. Un changement dans la dissipation de chaleur est égal à la variation d’enthalpie, libéré de toutes les réactions métaboliques dans l’ampoule. Ainsi, une enthalpie négative correspond à une perte de chaleur du système. Une recherche exhaustive sur les quatre dernières décennies a caractérisé le paysage thermodynamique du catabolisme et anabolisme. Ceci est représenté par une augmentation régulière des articles de recherche trouvé sous les termes de recherche « biologiques » et « calorimétrie » comme indexée par l’United States National Library of Medicine (NLM) à la National Institutes of Health (PubMed). La recherche révèle qu’avant 1970, un total de 27 publications référence biologique calorimétrique ; pendant ce temps, en 2016 seul, 546 publications a utilisé la technique.
Méthodes calorimétriques sont bien établies pour déterminer la production de chaleur. Cependant, davantage de souplesse est accordée pour régler la valeur respirométriques. La mesure respirométriques peut se composer d’O2, CO2, ou O2 et CO2. En outre, la mesure de O2 ou CO2 peut être accomplie par diverses techniques, dont la consommation, électrodes de type Clark et tunable diode laser absorption spectroscopy7,9,10 ,11. Alors que la production de CO2 est un indicateur précieux dans de nombreuses études respirométriques, le milieu de cellules cultivées utilise souvent un système tampon pH contrôle12,13bicarbonic. Pour éviter les complications de mesure de CO2 dans le système de bicarbonate, le protocole suivant pour la calorespirometry des cellules en culture utilise O2 comme paramètre respirométriques seul.
Parallèlement à la mesure de flux d’oxygène, certaines respiromètres (voir Table des matières) sont conçus pour des évaluations détaillées de la fonction mitochondriale. Substrat-découpleur-inhibiteur-titrages (costume) protocoles sont bien établies et sont compatibles avec les expériences visant à mesurer la membrane potentiels ou réactives de l’oxygène (DRO) formation14. Le protocole présenté pour calorespirometry des cellules intactes est compatible avec l’introduction des découpleurs chimiques tels que le carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) et l’oligomycine F0F1-ATP synthase inhibiteur. Grâce à l’ajout de FCCP, consommation d’oxygène peut être découplée de la production d’ATP, ce qui est utile pour évaluer l’impact de la thérapeutique possible sur peformance mitochondrial15. En outre, l’ajout de l’oligomycine éclaire l’ampleur de la respiration de la fuite. Ainsi, les mesures respirométriques effectuées au cours de la calorespirometry sont compatibles avec longs protocoles conçus pour élucider davantage la physiologie mitochondriale.
La mesure simultanée de dissipation de la chaleur et de flux d’oxygène permet le calcul du ratio calorespirometric (CR). Ce ratio est ensuite comparé à une constante de la Thornton ou l’oxycaloric théorique équivalente, qui s’étend entre-430 à-480 kJ mol-1 selon la lignée cellulaire ou tissulaire d’intérêt et le carbone supplémenté substrats1, 16. ainsi, un ratio de CR plus négatif révèle une augmentation des contributions de voies anaérobies à activité métabolique général. Par exemple, le ratio de CR pour la respiration des tissus musculaire systématique sans l’exécution active du travail varie entre -448-468 kJ mol-1, qui se trouve dans la plage du oxycaloric théorique équivalent17,18. Pendant ce temps, des cellules de mammifères cancéreuses cultivées dans un milieu riche en glucose affichent fermentation lactiques renforcée suite à la glycolyse et relativement faible engagement mitochondrial19. Ce résultats de phénotype ratios CR dans la plage de-490 à-800 kJ mol-1, démontrant une implication accrue des voies anaérobies dans le métabolisme cellulaire, comme l’a indiqué plus négatif CR ratios1,7, 16,20.
Distributeurs commerciaux et sans but lucratif, cellulaires et tissulaires actuellement offre des lignées de cellules provenant de plus de 150 espèces, avec presque 4 000 lignées de cellules dérivée de l’homme. Lignées cellulaires immortalisées sont des outils pratiques pour rapidement évaluer la toxicité d’agents thérapeutiques potentiels, dont plusieurs peuvent interférer directement ou indirectement avec les fonctions mitochondriales. À l’aide de cellules transformées au cours de dépistage des drogues peut être une valeur prédictive limitée en partie à cause de l’effet Warburg, une caractéristique de nombreux cancers. Souvent, les cancers génèrent de l’ATP de phosphorylation de substrat-niveau et maintiennent l’équilibre rédox grâce à la production de lactate sans engager pleinement la mitochondrie sous conditions aérobies19. Développement pharmaceutique est notoirement coûteux et inefficaces, avec environ 8 sur 9 composés testés dans des essais cliniques humains parviennent pas à atteindre le marché approbation21. Alors que le potentiel thérapeutique peut transférer dépistage initial en raison de la faible cytotoxicité dans les lignées cellulaires, il est possible que certains de ces composés sont mitotoxic. Sans une méthode appropriée pour détecter comment ces toxines peuvent nuire à l’équilibre de l’énergie dans les cellules primaires qui n’affichent pas l’effet Warburg, information critique est souvent négligée, désengorgement de développement thérapeutique dans les premiers stades.
Calorespirometry est une approche pratique et non invasive d’analyser l’activité métabolique dans une variété d’échantillons biologiques, y compris les cellules et les tissus. Le noyau du protocole présenté est compatible avec un éventail d’applications. Associée à une complication, cependant, a été identifiée. Les cellules immortalisées sont souvent cultivées dans un milieu sans glucose additionné de galactose afin d’accroître la contribution de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) pour la production d’énergie, afin de sensibiliser les cellules à potentiel mitotoxins22, 23. Cette reprogrammation métabolique semble obscure analyse lorsque les échantillons sont placés dans les ampoules en acier inoxydable utilisés par le calorimètre à15. Les cellules cultivées dans un milieu glucosé continuent à s’engager dans l’activité métabolique intense pendant plusieurs heures. Pendant ce temps, les cellules cultivées dans un milieu galactose diminuent de la production de chaleur dans les 30 minutes de leur placement dans l’ampoule, la mesure limitée aux premiers moments expérimentale. Malheureusement, ce comportement, fait obstacle à l’occasion d’évaluer leur prolifération cellulaire. Malgré cette limitation spécifique, la plupart des applications sont compatibles avec l’analyse calorespirometric et informations métaboliques détaillées peuvent être obtenues grâce à cette approche.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif de calorespirometry est d’évaluer quantitativement les contributions des voies aérobies et anaérobies à activité métabolique et d’obtenir une vue composite de flux d’énergie cellulaire. Ceci est accompli par une mesure simultanée de la dissipation de la chaleur et le flux d’oxygène suivie d’une comparaison entre le ratio calculé de CR avec l’oxycaloric théorique équivalente. Plusieurs étapes critiques doivent être considérés pour des données fiables et reproductibles. Le maintien…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé en partie par la subvention de la National Science Foundation CHE-160944 à Mary E. Konkle et Michael A. Menze.
Materials
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum – Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
Riferimenti
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