Calorespirometry: Un approccio potente, non invasivo per studiare il metabolismo energetico cellulare
Summary
Questo protocollo descrive calorespirometry, la misura diretta e simultanea di dissipazione di calore e di respirazione, che fornisce un approccio non invasivo per valutare il metabolismo energetico. Questa tecnica è utilizzata per valutare il contributo delle vie sia aerobiche e anaerobiche per l’utilizzazione di energia di monitoraggio del flusso totale di energia cellulare.
Abstract
Molte linee cellulari utilizzate nella ricerca biologica e biomedica di base mantengono l’omeostasi energetica attraverso una combinazione di respirazione sia aerobico che anaerobico. Tuttavia, nella misura in cui sia vie contribuiscono al paesaggio della produzione di energia cellulare è costantemente trascurata. Trasformato le cellule coltivate in saturando i livelli di glucosio spesso mostrano una dipendenza in diminuzione su fosforilazione ossidativa per la produzione di ATP, che viene compensata da un aumento nella fosforilazione del substrato-livello. Questo spostamento nell’equilibrio metabolico permette alle cellule di proliferare nonostante la presenza di tossine mitocondriali. Trascurando l’alterato equilibrio metabolico delle cellule trasformate, i risultati di uno screening farmaceutico potrebbero essere interpretata erroneamente dal potenzialmente effetti mitotoxic non possono essere rilevati utilizzando modello linee cellulari coltivate in presenza di elevati del glucosio concentrazioni. Questo protocollo descrive l’accoppiamento di due potenti tecniche, manometrica e Calorimetria, che consente la valutazione quantitativa e non invadente dei contributi sia aerobici ed anaerobici per la produzione di ATP cellulare. Respirazioni sia aerobici ed anaerobici generano calore, che può essere monitorato tramite calorimetria. Nel frattempo, la misurazione del tasso di consumo di ossigeno può valutare l’entità della respirazione aerobica. Quando sia la dissipazione di calore e consumo di ossigeno sono misurati simultaneamente, il rapporto di calorespirometric può essere determinato. Il valore ottenuto sperimentalmente può essere confrontato all’equivalente di oxycaloric teorico e nella misura della respirazione anaerobica può essere giudicata. Così, calorespirometry fornisce un metodo unico per analizzare una vasta gamma di domande biologiche, tra cui lo sviluppo di farmaci, la crescita microbica e bioenergetica fondamentale sia in normossia e in condizioni di ipossia.
Introduction
Nei sistemi biologici, il rilascio di calore o entalpia cambiamento durante il metabolismo è in genere monitorati sia direttamente (tramite diretta calorimetria) o indirettamente tramite il consumo di O2 e/o produzione di CO2 (via manometrica). Sfortunatamente, quando queste tecniche sono utilizzate in isolamento, informazioni critiche vengono perse, come il contributo delle vie anaerobiche al metabolismo cellulare. Calorespirometry è una potente tecnica che si basa sulla misurazione simultanea di dissipazione di calore e di respirazione. Calorespirometric lavoro pionieristico studiato il metabolismo anaerobico in cellule di mammiferi completamente ossigenate e dimostrato contributi simultanei dei percorsi sia aerobici che anaerobici di omeostasi energetica nonostante le cellule trasformate in un ambiente completamente ossigenato1. Calorespirometry da allora è stato applicato a una vasta gamma di domande biologiche. Alcuni esempi includono lo studio dell’animale energetica a bassi livelli di ossigeno, gli effetti di erbicidi e di estrogeno sulle lamelle di molluschi bivalvi, il metabolismo degli organismi terrestri e la decomposizione microbica di materia organica del suolo2, 3 , 4 , 5 , 6. Inoltre, calorespirometry ha rivelato come metabolica precondizionamento prima del congelamento migliora la crioconservazione di mammiferi celle7. Ogni approccio, sia calorimetria e manometrica, indipendentemente ha aumentato la nostra conoscenza della bioenergetica cellulare e organismica. Tuttavia, fondamentali domande biologiche che possono essere risolte attraverso l’uso di calorespirometry rimangono relativamente inesplorate.
Leggi di Hess afferma che la variazione di entalpia totale di una reazione è indipendente del pathway tra gli stati iniziali e finali. Ad esempio, la variazione di entalpia totale per una via biochimica è la somma della variazione di entalpie di tutte le reazioni all’interno della via. Calorimetria offre un approccio in tempo reale per misurare la produzione di calore cellulare, che rileva indiscriminatamente vie sia aerobiche che anaerobiche. Questo si basa sul fondamento che nessuna energia viene scambiata nel sistema tranne attraverso le pareti della fiala sperimentale8. Un cambiamento nella dissipazione del calore è uguale al cambiamento di entalpia rilasciato da tutte le reazioni metaboliche in fiala. Così, un negativo entalpia correla ad una perdita di calore dal sistema. Ricerche approfondite negli ultimi quattro decenni ha caratterizzato il paesaggio termodinamico di anabolismo e catabolismo. Questo è rappresentato da un aumento costante nella ricerca articoli trovati sotto i termini di ricerca “biologici” e “calorimetria” come indicizzato dallo Stati Uniti National Library di medicina (NLM) presso il National Institutes of Health (PubMed). La ricerca rivela che prima del 1970, un totale di 27 pubblicazioni riferimento biologico calorimetria; nel frattempo, nel 2016 da solo, 546 pubblicazioni utilizzato la tecnica.
Metodi calorimetrici sono ben stabiliti per determinare la produzione di calore. Tuttavia, una maggiore flessibilità è concesso per la risoluzione il valore respirometriche. La misurazione respirometriche può consistere di O2, CO2, o O2 e CO2. Ulteriormente, la misura di O2 o CO2 può essere compiuta mediante varie tecniche, tra cui optrodes, Clark-tipo di elettrodi e diodo tunable laser assorbimento spettroscopia7,9,10 ,11. Mentre la produzione di CO2 è una metrica preziosa in molti studi respirometriche, il supporto per le cellule coltivate spesso utilizza un sistema di buffer di bicarbonic per controllo pH12,13. Per evitare complicazioni di CO2 misura nel sistema di bicarbonato, il seguente protocollo per la calorespirometry delle cellule nella cultura utilizza O2 come unico parametro respirometriche.
In concomitanza con cambiamento continuo dell’ossigeno di misurazione, alcuni respirometers (Vedi Tabella materiali) sono progettati per valutazioni dettagliate della funzione mitocondriale. Substrato-disaccoppiatore-inibitore-titolazioni (SUIT) protocolli sono ben stabiliti e sono compatibili con gli esperimenti progettati per misurare la membrana potenziale o reattive dell’ossigeno (ROS) specie formazione14. Il protocollo presentato per calorespirometry di cellule intatte è compatibile con l’introduzione della chimica uncouplers come Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone (FCCP) e l’inibitore oligomycin di F0F1-ATP sintasi. Attraverso l’aggiunta di FCCP, consumo di ossigeno può essere disgiunto dalla produzione di ATP, che è utile per valutare l’impatto di potenziali terapie su mitocondriale peformance15. Inoltre, l’aggiunta di oligomycin si illumina nella misura della respirazione di perdita. Così, le misure respirometriche eseguite durante calorespirometry sono compatibili con protocolli vasti progettati più ulteriormente per delucidare fisiologia mitocondriale.
La misura simultanea di dissipazione di calore e di cambiamento continuo dell’ossigeno consente il calcolo del rapporto calorespirometric (CR). Questo rapporto viene quindi confrontato con costante di Thornton o il oxycaloric teorico equivalente, che spazia tra -430 a-480 kJ mol-1 a seconda della varietà di cellula o tessuto di interesse e il carbonio completati substrati1, 16. quindi, un rapporto più negativo di CR rivela maggiori contributi da vie anaerobiche per complessivo activity. Ad esempio, il rapporto di CR per la respirazione dei tessuti muscolo routine senza l’attiva delle prestazioni di lavoro varia da-448 a-468 kJ mol-1 che è all’interno della gamma del oxycaloric teorico equivalente17,18. Nel frattempo, le cellule tumorali dei mammiferi coltivate in medium che è ad alto contenuto di glucosio visualizzare fermentazione acido lattico avanzata seguendo la glicolisi e relativamente basso coinvolgimento mitocondriale19. Questo risultati di fenotipo in rapporti di CR nell’intervallo di-490 a-800 kJ mol-1, dimostrando una maggiore partecipazione delle vie anaerobiche nel metabolismo cellulare come indicato da più negativa CR rapporti1,7, 16,20.
Distributori di cellule e tessuti sia commerciali che senza scopo di lucro attualmente offerta linee cellulari provenienti da oltre 150 specie, con quasi 4.000 linee cellulari derivano da esseri umani. Linee cellulari immortalizzate sono strumenti utili per valutare rapidamente la tossicità delle terapie potenziali, molte delle quali possono interferire direttamente o indirettamente con funzioni mitocondriali. Utilizzando cellule trasformate durante lo screening di stupefacenti può essere di limitato valore predittivo in parte a causa dell’effetto di Warburg, un segno distintivo di molti cancri. Spesso, i cancri generano ATP da fosforilazione del substrato-livello e mantengono l’equilibrio redox attraverso la produzione di lattato senza impegnarsi pienamente il mitocondrio sotto condizioni aerobiche19. Sviluppo farmaceutico è notoriamente costoso ed inefficiente, con circa 8 su 9 composti provati nei test clinici umani non riuscendo a ottenere l’approvazione del mercato21. Mentre terapeutica potenziale può passare uno screening iniziale a causa della bassa citotossicità nelle linee cellulari, è possibile che alcuni di questi composti sono mitotoxic. Senza un metodo adatto per rilevare come queste tossine possono alterare l’equilibrio di energia nelle cellule primarie che non vengono visualizzati l’effetto Warburg, informazione critica è spesso sovra-sembrava, strozzature sviluppo terapeutico nelle fasi iniziali.
Calorespirometry è un approccio pratico, non invadente per analizzare l’attività metabolica in una varietà di campioni biologici, compreso le cellule e tessuti. Il nucleo del protocollo presentato è compatibile con una gamma di applicazioni. Una complicazione, tuttavia, è stata identificata. Cellule immortalizzate sono spesso coltivate in un medium privo di glucosio, completato con galattosio per aumentare il contributo della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per la produzione di energia, al fine di sensibilizzare le cellule a potenziali mitotoxins22, 23. Questa riprogrammazione metabolico sembra oscurare analisi quando i campioni vengono inseriti nelle fiale di acciaio inossidabile utilizzate dal calorimetro15. Le cellule coltivate in un medium del glucosio continuano ad impegnarsi in alta attività metabolica per diverse ore. Nel frattempo, le cellule coltivate in medium galattosio diminuiscono la produzione di calore entro 30 min della loro collocazione in fiala, effettuare misure limitate ai punti di tempo sperimentale in anticipo. Questo comportamento, purtroppo, ostacola la possibilità di valutare la loro proliferazione cellulare. Nonostante questa limitazione specifica, la maggior parte delle applicazioni sono compatibili con l’analisi calorespirometric e dettagliate informazioni metaboliche possono essere ottenute attraverso questo approccio.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’obiettivo di calorespirometry è quello di valutare quantitativamente i contributi dei percorsi aerobici ed anaerobici di attività metabolica e ottenere una vista composta di flusso di energia cellulare. Ciò avviene mediante una misura simultanea di dissipazione del calore e flusso di ossigeno seguita da un confronto tra il rapporto CR calcolato con il teorico oxycaloric equivalente. Diversi passaggi critici devono essere considerate per dati riproducibili e affidabili. Il mantenimento di una cultura sterile cellula …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla sovvenzione della National Science Foundation-160944 Mary E. Konkle e Michael A. Menze.
Materials
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum – Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
Riferimenti
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