Calorespirometry: Мощный, неинвазивная подход к расследованию клеточной энергии метаболизма
Summary
Этот протокол описывает calorespirometry, прямой и одновременное измерение тепловыделением и дыхания, который обеспечивает неинвазивная подход к оценке энергии метаболизма. Этот метод используется для оценки вклада аэробных и анаэробных пути использования энергии путем наблюдения за общей клеточной энергии потока.
Abstract
Многие клеточных линий, используемых в основных биологических и биомедицинских исследований поддержания энергетического гомеостаза через сочетание аэробных и анаэробных дыхание. Однако степень которой оба пути способствовала пейзаж клеточной энергии производства постоянно забывают. Преобразованные клетки культивировали в насыщения уровней глюкозы часто показывают снижение зависимости на Оксидативное фосфорилирование для производства АТФ, которое компенсируется увеличением в субстрат уровня фосфорилирования. Этот сдвиг в метаболические равновесием позволяет клетки размножаются несмотря на присутствие митохондриальной токсинов. В пренебрегая изменены метаболические равновесием трансформированных клеток, результаты от фармацевтической скрининга могут быть неправильно истолкованы с потенциально mitotoxic эффекты не могут быть обнаружены с помощью модели линии клетки культивировали в присутствии высоких глюкозы концентрации. Этот протокол описывает сопряжения двух мощных методов, калориметрия, который позволяет для оценки количественных и неинвазивной аэробных и анаэробных взносов сотовой производства АТФ и respirometry. Аэробных и анаэробных дыхание генерировать тепло, которое может быть контроль через калориметрии. Тем временем измерения скорость потребления кислорода может оценить степень аэробном дыхании. Когда одновременно измеряется как тепла, так и потребление кислорода, calorespirometric соотношения могут быть определены. Экспериментально полученное значение затем можно сравнить с теоретической oxycaloric эквивалент, и степень анаэробного дыхания можно судить. Таким образом calorespirometry обеспечивает уникальный метод для анализа широкий спектр биологических вопросов, включая разработки лекарств, микробного роста и основных Биоэнергетика под нормоксические и гипоксических условий.
Introduction
В биологических системах, тепло release или энтальпии в ходе метаболизма изменяется обычно контролируется либо непосредственно (через Прямая калориметрия) или косвенно через O2 потребления или производства CO2 (через respirometry). К сожалению когда эти методы используются в изоляции, критической информации теряется, как вклад анаэробных пути для клеточного метаболизма. Calorespirometry – это мощный метод, который опирается на одновременное измерение рассеивание тепла и дыхания. Новаторская работа calorespirometric расследование анаэробного метаболизма полностью кислородом клеток млекопитающих и продемонстрировал одновременный вклад аэробных и анаэробных пути энергетического гомеостаза несмотря на трансформированных клеток, находящихся в 1полностью кислородом среде. Calorespirometry с тех пор был применен к широкий спектр биологических вопросов. Некоторые примеры включают изучение животных энергетики на уровнях низким содержанием кислорода, воздействия гербицидов и эстрогена на жабрах двустворчатые моллюски, метаболизм земных организмов и микробного разложения органических почв вопрос2, 3 , 4 , 5 , 6. Кроме того, имеет calorespirometry показал как метаболические кондиционирования до замораживания улучшает криоконсервирования млекопитающих клетки7. Каждый подход, калориметрии и respirometry, самостоятельно увеличилась наши знания о клеточном и научные биоэнергетики. Однако основные биологические вопросы, которые можно ответить с помощью calorespirometry остаются сравнительно неизученными.
Закон Гесса утверждает, что изменение общей энтальпии реакции не зависит от пути между начальной и конечной государствами. Например изменение общей энтальпии на биохимические пути является суммирование с изменением энтальпии всех реакций в пути. Калориметрия предлагает в реальном времени подход для измерения производства ячеистого тепла, который неизбирательно обнаруживает аэробных и анаэробных пути. Это основано на фундаменте, что без энергии осуществляется в системе за исключением через стены экспериментальной ампулы8. Изменения в тепловыделение равен изменения энтальпии, освобождены от всех метаболических реакций в ампулы. Таким образом негативные энтальпии коррелирует к потере тепла от системы. Исчерпывающие исследования за последние четыре десятилетия характеризуется термодинамических ландшафт анаболизма и катаболизма. Это представлено устойчивый рост в научных статей, найденных под условия поиска «биологического» и «теплофизика» как индексированных по Соединенных Штатов национальной библиотеки из медицины (NLM) в национальном институте здоровья (PubMed). Поиск показывает, что до 1970 года, в общей сложности 27 публикаций ссылка биологических калориметрии; Тем временем в 2016 году в одиночку, 546 публикаций использовали технику.
Калориметрических методов хорошо известны, чтобы определить производства тепла. Однако для разрешения использованием респирометрической значение предоставляется больше гибкости. Использованием респирометрической измерения может состоять из O2, CO2, или O2 и CO2. Кроме того измерение O2 или CO2 может быть достигнуто путем различных методов, включая optrodes, Кларк тип электродов и перестраиваемые Диод лазера поглощения спектроскопии7,9,10 ,11. В то время как CO2 производства является ценным метрики во многих исследованиях использованием респирометрической, средство для культивируемых клеток часто использует bicarbonic буферную систему для контроля рН12,13. Чтобы избежать осложнений CO2 измерения в системе бикарбонат, следующий протокол для calorespirometry клеток в культуре использует O2 в качестве единственного параметра использованием респирометрической.
Одновременно с измерением потока кислорода, некоторые respirometers (см. Таблицу материалы) предназначены для детальной оценки функции митохондрий. Субстрат uncoupler ингибитор титрования (костюм) протоколы хорошо разработаны и совместимы с эксперименты, предназначенные для измерения мембраны потенциальных или реактивного кислорода (АФК) формирование14. Представленные протокол для calorespirometry нетронутым клеток совместим с введением химических uncouplers карбонильные цианид p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) и oligomycin ингибитора синтазы F0F1-АТФ. Путем добавления FCCP потребление кислорода может быть центровку от производства АТФ, который является полезным для оценки воздействия потенциальных терапевтических средств на митохондриальной peformance15. Кроме того добавление oligomycin освещает масштабы утечки дыхания. Таким образом использованием респирометрической измерений во время calorespirometry совместимы с обширной протоколы, разработанные для дальнейшего прояснения митохондриальной физиологии.
Одновременное измерение рассеивание тепла и кислорода потока позволяет расчет коэффициента calorespirometric (CR). Это соотношение затем сравнивается с константой Торнтон или теоретический эквивалент, oxycaloric, которая колеблется между-430–480 кДж моль-1 в зависимости от линии клетки или ткани интереса и дополнено углеродных подложках1, 16. Таким образом, более негативное отношение CR показывает увеличение взносов от анаэробных пути к общей метаболической активности. Например коэффициент CR для рутинной мышц тканевого дыхания без активного выполнения работы варьируется от-448 до-468 кДж моль-1, который находится в пределах диапазона теоретических oxycaloric эквивалентную17,18. Тем временем млекопитающих раковые клетки культивировали в среде, что является высоким содержанием глюкозы отображения расширенной молочнокислое брожение после гликолиза и относительно низкой митохондриальной участие19. Этот фенотип результаты в соотношениях CR в диапазоне-490–800 кДж моль-1, демонстрируя повышенное участие анаэробных путей в клеточный метаболизм, как указано на, более негативные CR соотношения1,7 16,20.
Коммерческие и некоммерческие клеток и тканей дистрибьюторов в настоящее время предложение клеточных линий более 150 видов, с почти 4000 клеточных линий, полученных от людей. Удобные инструменты для быстрого оценки токсичности потенциальных терапевтических средств, многие из которых могут прямо или косвенно вмешиваться в митохондриальной функции увековечен клеточных линий. С помощью трансформированных клеток во время наркотиков скрининг может быть ограниченной прогностическая ценность отчасти из-за эффекта Варбург, отличительной чертой многих раковых заболеваний. Часто рака генерировать СПС от субстрата уровня фосфорилирования и поддерживать окислительно-восстановительного баланса путем производства молочной кислоты без полного вовлечения митохондрий в аэробных условиях19. Фармразработка крайне дорого и неэффективно, с примерно 8 из 9 соединений, протестированы в клинические испытания на человеке не достигают рынок утверждения21. В то время как потенциальные терапии может пройти первоначальный отбор из-за низкой цитотоксичность в клеточных линий, вполне возможно, что некоторые из этих соединений являются mitotoxic. Без подходящий метод для обнаружения, как эти токсины могут ухудшить энергетический баланс в клетках первичной, которые не отображают эффект Варбург критической информации часто чрезмерно посмотрел, обнаружены терапевтические развития на ранних стадиях.
Calorespirometry является Неинвазивная подход для анализа метаболической активности в различных биологических проб, в том числе клеток и тканей. Основные представленные протокол совместим с широкого спектра приложений. Одно осложнение, однако, была обнаружена. Увековечен клетки часто выращиваются в среде свободной глюкозы, дополнена галактозы для увеличения вклада окислительного фосфорилирования (OXPHOS) для производства энергии, с целью информирования клетки потенциальные mitotoxins22, 23. Этот метаболических перепрограммирования, как представляется, закрывают анализа, когда образцы помещаются в ампулах из нержавеющей стали, используемые в калориметре15. Клетки культивировали в среде глюкозы по-прежнему участвовать в высокой метаболической активности в течение нескольких часов. Тем временем клетки культивировали в галактозы средних уменьшение производства тепла в течение 30 минут их размещения в ампулы, делая ограничивается заблаговременно экспериментальных точек измерения. Это поведение, к сожалению, препятствует возможность оценить их пролиферации. Несмотря на это конкретные ограничения большинство приложений совместимы с calorespirometric анализом и метаболические подробную информацию можно получить через этот подход.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель calorespirometry заключается в том, чтобы количественно оценить вклад аэробных и анаэробных пути к метаболической активности и получить составное представление потока клеточной энергии. Это достигается путем одновременного измерения тепла и поток кислорода, следуют сравнение расчетны?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично финансируется Национальный научный фонд Грант ЧЕ-160944 Мэри э. Konkle и Майкл а. Мензе.
Materials
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum – Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
Riferimenti
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E., Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. , 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. . Human Calorimetry. , (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Ricerca sul cancro. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
