Fractionnement subcellulaire de spécimens gastro-intestinal fraîches ou congelées
Summary
Nous présentons ici un protocole pour effectuer un simple fractionnement cellulaire pour la séparation subcellulaire des protéines cytoplasmiques et nucléaires dans des biopsies intestinales humaines fraîches ou congelées.
Abstract
Le but du présent protocole est de fractionner le tissu intestinal humain obtenu par endoscopie en compartiments nucléaires et cytoplasmiques pour l’analyse de la localisation des protéines spécifiques ou complexes de protéines dans les États de différents tissus (c’est-à-dire, en bonne santé contre la maladie). Cette méthode est utile pour le fractionnement des deux échantillons de tissu intestinal frais et surgelés ; Il est facilement accessible pour tous les laboratoires et pas beaucoup de temps.
Introduction
Les protéines participent à presque toutes les fonctions biologiques dans une cellule et toute variation dans leur structure, la quantité ou la localisation peut conduire à un scénario de pathogène. Méthodes de fractionnement des échantillons tissulaires sont une approche utile pour réduire la complexité des maladies liées à des analyses de protéines. Certaines études utilisent des informations de localisation de protéine ou enrichissent une protéine d’un compartiment cellulaire spécifique, un protocole pour le fractionnement des protéines intactes reproductible est donc utile de répondre à certaines questions biologiques. Déterminer la localisation sous-cellulaire des protéines et la surveillance de leurs interactions à basale ou redistribution compartimentale et pathologiques permettra d’identifier les maladies liées à des différences fonctionnelles1,2. Ainsi, cette méthode vise de façon reproductible fractionner des biopsies de tissu intestinal, frais et surgelés, en compartiments subcellulaires cytoplasmiques et nucléaires.
Des échantillons de biopsie intestinale sont régulièrement obtenus au cours de l’endoscopie procédures3 (Figure 1) et peuvent être utilisés efficacement pour la quantification des protéines ou des études de l’immunoprécipitation. Étant donné que les échantillons de tissus d’intestinales épithéliales contiendra des protéines qui peuvent être directement impliqués dans la pathogenèse de la maladie4, biopsies intestinales sont une source très précieuse pour l’identification réussie des propres à la maladie intestinale protéines. Des échantillons de tissus de surgelés, patient stockée ainsi que les renseignements cliniques sont des ressources utiles pour l’analyse des protéines, et une préparation simple et reproductible est un enjeu important de fournir des informations parcellaires cellule à l’aide de montants limitatifs de surgelés tissu5.
Il existe plusieurs kits disponibles dans le commerce pour la séparation des fractions cellulaires, mais ceux-ci sont plus chers et généralement plus long que le protocole présenté ici. Protocoles basés sur la centrifugation en gradient de plusieurs étapes et des gradients continus ont également servis antérieurement pour le fractionnement des divers compartiments cellulaires dans différents tissus6,7. Cependant, maintenir l’uniformité des gradients continus est souvent une tâche difficile. Protocoles similaires basées sur la lyse séquentielle des membranes ont été décrits précédemment mais dont ils ont besoin en général de plus de deux tampons et les mains à l’heure n’est plus8 .
Lorsque des échantillons de tissus de fractionnement, garder à l’esprit que le tissu des échantillons présents cellule-cellule et cellule-matrice des interactions qui ne sont pas présentes dans les cellules cultivées et important lors de l’extraction de protéines. La ventilation correcte entre cellules et matrice extracellulaire sans affecter la qualité de la protéine sera un facteur essentiel dans le tissu intestinal protéine isolement9. Dans ce protocole, cellule-cellule et cellule-matrice de contacts sont d’abord cassés, libérant les cellules et qui permet la mémoire tampon atteindre les cellules individuelles. Pour éviter les protéines-compartiment mélangés avant le fractionnement, la rupture des contacts doit se faire sans altérer l’intégrité des cellules ou les membranes nucléaires.
En raison de l’enrichissement de diverses protéases dans la muqueuse intestinale10, il est important de contrôler la dégradation des protéines durant l’extraction. Pour minimiser la dégradation potentielle de la protéine, inhibiteur de la protéase multiples doit être inclus dans les tampons d’extraction de protéine. En outre, si des extraits vont être utilisés pour les tests fonctionnels, il est essentiel pour éviter la dénaturation des protéines ou de protéolyse, car cela provoquerait une perte de protéines activité11. À cet effet, le protocole est réalisé à 4 ° C et fluorure phénylméthylsulfonyle fraîches (PMSF) est ajouté pour les tampons à une concentration finale de 0,1 mM juste avant de les utiliser davantage inhibe la protéolyse.
La première étape de fractionnement cellulaire est désorganisation tissulaire et la lyse cellulaire. Tel que mentionné précédemment, l’objectif est de séparer les cellules et la pause que les ouvrir avec le minimum de dommages. Échantillons de tissu intestinal doivent être homogénéisés, et les cellules lysées pour atteindre maximale rupture de la membrane cellulaire. Dans ce protocole, nous utilisons un mélangeur motorisé pilon pour briser le tissu intestinal qui est homogénéisé dans secondes au moyen d’action Vortex à haute vitesse. Après homogénéisation, les cellules des tissus sont incubés dans une mémoire tampon hypotonique qui fera éclater la membrane cellulaire, mais gardera les noyaux intacts, suivie par l’ajout d’un détergent non dénaturants (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) et un court vortex pour séparer les noyaux de la fraction cytoplasmique. Après l’enlèvement du cytoplasme, la membrane du noyau cellulaire est fait irruption dans un tampon hypertonique avec agitation.
La méthode présentée ici est une méthode appropriée pour le fractionnement subcellulaire des frais et congelés des biopsies intestinales qui ont été obtenus au cours de procédures endoscopiques et comprise entre 2 et 10 mg en poids. Le protocole est simple et reproductible et pourrait être effectué à l’aide de matériel de laboratoire de base et des réactifs en moins d’une heure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici est utilisé pour le fractionnement nucléaire et cytoplasmique des biopsies de l’intestin. Les protéines purifiées sont non dénaturés et peut être utilisés non seulement dans l’analyse par western blot comme montré dans la Figure 2 et 3 , mais aussi dans les essais nécessitant des protéines pliées natif comme immunoprécipitation, analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) ou électrophorèse en natif sur gel de polya…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs reconnaissent l’aide de Ander Lopez et Miren Telletxea pour l’enregistrement et le montage vidéo. ACR est financé par une bourse de Ikerbasque et un projet de recherche de Asociación de Celiacos Madrid (ACM). JRB est financé par le projet ISCIII-PI16/00258 et cofinancé par l’Union européenne FEDER/FSE « Un moyen de faire de l’Europe ». EST financé par une subvention de projet de recherche 2015111068 du département Basque de la santé. GRI et AJM sont pris en charge par des subventions de bourse prédoctorale de l’UPV/EHU et le ministère de l’éducation de Basque, respectivement.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
Riferimenti
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. . Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. . Protein purification protocols. , (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
