Frazionamento subcellulare dagli esemplari gastrointestinali freschi e surgelati
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un frazionamento cellulare semplice per la separazione subcellulare delle proteine citoplasmatiche e nucleari in biopsie intestinali umane fresche e congelate.
Abstract
Lo scopo del presente protocollo è quello di frazionare il tessuto intestinale umano ottenuto dall’endoscopia in compartimenti nucleari e citoplasmatici per l’analisi di localizzazione di specifiche proteine o complessi proteici in stati differenti del tessuto (cioè, sano vs malattia). Questo metodo è utile per il frazionamento di entrambi i campioni freschi e congelati di tessuto intestinale; è facilmente accessibile per tutti i laboratori e non richiede molto tempo.
Introduction
Proteine partecipano a quasi tutte le funzioni biologiche all’interno di una cella e qualsiasi variazione nella loro struttura, la quantità o la posizione può portare a uno scenario di patogeno. Metodi di frazionamento dei campioni del tessuto sono un utile approccio per ridurre la complessità della malattia relative analisi di proteine. Alcuni studi utilizzano informazioni di localizzazione della proteina o arricchiscono una proteina da un compartimento cellulare specifico, quindi un protocollo per il frazionamento riproducibile di proteine intatte è utile per rispondere a taluni quesiti biologici. Determinare la localizzazione subcellulare delle proteine e monitoraggio loro ridistribuzione compartimentali o interazioni al basale e condizioni di malattia verranno aiuterà a identificare la malattia relative differenze funzionali1,2. Questo metodo intende quindi, riproducibile frazionare le biopsie del tessuto intestinale sia fresche che congelate, in compartimenti subcellulari citoplasmatici e nucleari.
I campioni di biopsia intestinale sono ordinariamente ottenuti durante l’endoscopia procedure3 (Figura 1) e possono essere efficacemente utilizzati per la quantificazione della proteina o studi di immunoprecipitazione. Dal momento che i campioni di tessuto da intestinale epiteliali conterrà le proteine che possono essere direttamente coinvolti in patogenesi malattia4, campioni di biopsia intestinale sono una fonte molto preziosa per l’identificazione di successo di specifica di malattia intestinale proteine. Campioni di tessuto congelato, paziente memorizzati insieme con le informazioni cliniche sono risorse utili per l’analisi della proteina, e una preparazione del campione semplice e riproducibile è una questione chiave per fornire informazioni compartimentali cella utilizzando quantità limitante di congelati tessuto5.
Ci sono diversi kit disponibile in commercio per la separazione di frazioni cellulari, ma questi sono più costosi e in genere richiede più tempo rispetto al protocollo presentato qui. Protocolli basati su centrifugazione in gradiente di più-passaggio e pendenze continue inoltre sono state usate in precedenza per il frazionamento dei diversi compartimenti cellulari in diversi tessuti6,7. Tuttavia, mantenendo la coerenza delle pendenze continue è spesso un compito difficile. Simili protocolli basati sulla sequenza lisi delle membrane precedentemente sono stati descritti, ma hanno bisogno generalmente più di due buffer e le mani sul tempo è più lungo di8 .
Quando i campioni di tessuto di frazionamento, tenete a mente che il tessuto campioni presenti cellula-cellula e cellula-matrice interazioni che sono presenti nelle cellule in coltura non sia importante quando si procede all’estrazione della proteina. La corretta ripartizione tra cellule e matrice extracellulare senza compromettere la qualità di proteina sarà un fattore critico nel tessuto intestinale della proteina isolamento9. In questo protocollo, contatti cellula-cellula e cellula-matrice in primo luogo sono rotti, liberando le cellule e permettendo che il buffer raggiungere le singole celle. Per evitare la proteina-vano di miscelazione prima del frazionamento, la ripartizione dei contatti deve avvenire senza alterare l’integrità delle membrane nucleari o le celle.
Dovuto l’arricchimento di varie proteasi nella mucosa intestinale10, è importante controllare la degradazione della proteina durante l’estrazione. Per ridurre al minimo il potenziale degradazione della proteina, più l’inibitore della proteasi deve essere incluso nei buffer di estrazione di proteine. Inoltre, se estratti stanno per essere utilizzati per analisi funzionali, è essenziale per evitare la denaturazione delle proteine o proteolisi ciò causerebbe una perdita di proteina attività11. Per questo scopo, il protocollo viene eseguito a 4 ° C e fluoruro di phenylmethylsulfonyl fresco (PMSF) viene aggiunto al buffer ad una concentrazione finale di 0,1 mM appena prima dell’uso per inibire ulteriore proteolisi.
Il primo passo nel frazionamento delle cellule è la rottura del tessuto e lisi cellulare. Come accennato in precedenza, l’obiettivo è quello di disaggregare le cellule e la rottura che li aperto con danni minimi. Campioni di tessuto intestinale devono essere omogeneizzati, e le cellule lisate per ottenere massima rottura della membrana cellulare. In questo protocollo, usiamo un mixer motorizzato pestello per rompere il tessuto intestinale che è omogeneizzato in pochi secondi mediante azione Vortex ad alta velocità. Dopo omogeneizzazione, cellule del tessuto vengono incubate in un buffer ipotonico che scoppierà la membrana delle cellule, ma manterrà i nuclei intatti, seguita dalla aggiunta di un detergente non-denaturante (nonil phenoxypolyethoxylethanol) e un breve vortice per separare i nuclei dalla frazione citoplasmatica. Dopo la rimozione del citoplasma, la membrana di nuclei delle cellule è scoppiò in un buffer ipertonico con agitazione.
Il metodo presentato qui è un metodo appropriato per il frazionamento subcellulare di biopsie intestinali freschi e congelati che sono stati ottenuti durante le procedure endoscopiche e intervallo tra 2 e 10 mg di peso. Il protocollo è semplice e riproducibile e può essere eseguito utilizzando apparecchiature di laboratorio di base e i reagenti in meno di un’ora.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui è usato per il frazionamento nucleare e citoplasmatico di biopsie intestinali. Le proteine purificate non sono denaturate e può essere utilizzate non solo nell’analisi di western blot come mostrato in Figura 2 e 3 , ma anche nelle analisi che richiedono nativo-piegato proteine quali immunoprecipitazione, analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA) o elettroforesi nativa del gel di poliacrilammide (PAGE).
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autori riconoscono l’assistenza di Ander Lopez e Miren Telletxea per la registrazione e l’editing dei video. ACR è finanziato da una borsa di studio Ikerbasque e un progetto di ricerca dal Asociación de Celiacos di Madrid (ACM). JRB è finanziato dal progetto ISCIII-PI16/00258 e co-finanziato dal FESR/FSE Unione europea “Un modo per fare dell’Europa”. È è finanziata da una sovvenzione di progetto di ricerca 2015111068 del basco dipartimento della salute. IRG e AJM sono supportate da sussidi per la fellowship predoctoral da UPV/EHU e il basco Department of Education, rispettivamente.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
Riferimenti
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