ביופילמים אוראלי על חומרים שונים עבור שתלים דנטליים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך ביופילמים אוראלי על חומרי טיטניום, אסתטיים תותבת שיניים abutments, כולל הניתוח של תאים חיידקיים הכדאיות ומאפיינים מורפולוגי. בחיי עיר מודל המשויך טכניקות במיקרוסקופ עוצמה משמשת לניתוח biofilm אוראלי.
Abstract
שתלים דנטליים ורכיבים תותבת שלהם נוטים מושבת חיידקים, ביופילמים. ושימוש בחומרים המספק הידבקות חיידקים נמוך עשוי להפחית את השכיחות של ההתקדמות של מחלות פרי-השתל. על רקע הסביבה אוראלי המורכבות ואת אורלי biofilm הטרוגניות, מיקרוסקופיה טכניקות הדרושים המאפשרים ניתוח biofilm של המשטחים של שיניים, חומרים דנטליים. מאמר זה מתאר סדרה של פרוטוקולים ליישם לצורך השוואת ביופילמים אוראלי על טיטניום, חומרים קרמיים של התותבת abutments, כמו גם השיטות מעורב biofilms אוראלי ניתוחים ברמות הסלולר מורפולוגיים. המודל בחיי עיר להעריך ביופילמים אוראלי על חומרי טיטניום, אסתטיים תותבת שיניים abutments כפי שמתואר במחקר זה מספק של שימור biofilm 48 שעות, ובכך להפגין הלימות מתודולוגי משביע רצון. מיקרוסקופ multiphoton מאפשרת הניתוח של נציג שטח של biofilm נוצרו על החומרים הבדיקה. בנוסף, השימוש fluorophores, העיבוד של תמונות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton מאפשרת הניתוח של הכדאיות חיידקי אוכלוסיה הטרוגנית מאוד של מיקרואורגניזמים. ההכנה של דגימות ביולוגיות מיקרוסקופ אלקטרונים מקדמת שימור מבני biofilm תמונות ברזולוציה טובה, אין ממצאים.
Introduction
Biofilms חיידקי מורכבים, יופי של מבנית מאורגן קהילות מיקרוביאלי, המאופיינת על ידי מגוון של מינים חיידקים לסנתז1,של מטריצה חוץ-תאית, פעילים ביולוגית פולימר2. הדבקה חיידקית על משטחים ביוטיים או והאביוטיים קודם היווצרות של קרומית הנרכש, המורכב בעיקר glycoproteins הרוק-1,–3,–4. חלש physicochemical אינטראקציות בין המיקרואורגניזמים את קרומית בתחילה הוקמה, ואחריו חזק יותר אינטראקציות בין חיידקי adhesins גליקופרוטאין רצפטורים של קרומית רכשה. גיוון מיקרוביאלי עולה בהדרגה דרך coaggregation של colonizers משנית אל הקולטנים של חיידקים שכבר צורף, ויוצרים קהילה התקדמות1,3,4, 5.
הומאוסטזיס של microbiota את הפה ואת שלה יחסים סימביוטיים עם המארח חשוב לשמירה על בריאות הפה. Dysbiosis בתוך biofilms אוראלי עלול להגביר את הסיכון להתפתחות עששת, מחלות חניכיים2,5. מחקרים קליניים להדגים קשר סיבה-תוצאה בין ההצטברות של biofilm שיניים או שתלים דנטליים לבין התפתחות דלקת חניכיים או פרי-שתל mucositis6,7. ההתקדמות של תהליך דלקתי שמוביל פרי-implantitis ואובדן הסוגר של השתל8.
שתלים דנטליים ורכיבים תותבת שלהם נוטים מושבת חיידקים ו- היווצרות biofilm9. ושימוש בחומרים עם ההרכב הכימי, הטופוגרפיה משטח המספק הידבקות חיידקים נמוך עשוי להפחית את שכיחות והתקדמות של השתל פרי מחלות9,10. טיטניום הוא החומר שהשתמשו בהם לייצור abutments תותבות על שתלים; עם זאת, חומרים קרמיים הוצגו לאחרונה, צוברים פופולריות כחלופה טיטניום בגלל תכונותיהם אסתטי ואת הביו11,12. גם חשוב, חומרים קרמיים קושרו עם פוטנציאל כביכול מופחתת לדבוק מיקרואורגניזמים, בעיקר בזכות שלהם חספוס פני השטח, wettability, אנרגיה חופשית משטח10,13.
מחקרים במבחנה תרמו להתקדמות משמעותית בהבנה של הידבקות חיידקים ירכה תותבת משטחים9,14,15,16,17. עם זאת, הסביבה דינאמית של חלל הפה, מאופיינות על ידי טמפרטורה משתנים, pH וזמינות התזונתי שלה, כמו גם על ידי הנוכחות של כוחות גזירה, אינה לשחזור במבחנה בפרוטוקולים ניסיוניים18, 19. כדי להתגבר על בעיה זו, דרך חלופית היא השימוש בחיי עיר מודלים של ביופילמים, ביתרון השומרת את המבנה התלת-ממדי שמחוץ ניתוח10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
הניתוח של מבנה מורכב biofilm נוצרו על מצעים אוראלי מחייב שימוש טכניקות במיקרוסקופ מסוגל להציג את העניין צפופה שטיחות25. סריקת מיקרוסקופ לייזר multiphoton הוא אפשרות מודרני עבור ניתוח מבנה biofilm26. הוא מאופיין על ידי שימוש אופטיקה לא לינארית עם מקור תאורה קרוב הגל האינפרא-אדום, פעמו עד femtoseconds27. שיטה זו מצוינת עבור התמונה רכישת חומרים autofluorescence או חומרים מסומן על ידי fluorophores, בנוסף תמונות שנוצרו בעזרת אותות אופטי שאינו ליניארי נגזר תופעה הידועה דור הרמונית. בין היתרונות של מיקרוסקופ multiphoton הוא עומק תמונה מצוינת שהושג עם התאים המיזערי הנזק שנגרם על ידי עוצמת האור עירור27.
עבור בדיקת הכדאיות של biofilm על משטחים והאביוטיים על ידי מיקרוסקופ multiphoton, השימוש של חומצות גרעין פלורסנט צבענים עם מאפיינים שונים ספקטרלי, יכולת חדירה של תאים חיידקיים נדרש28. Fluorophores SYTO9 (ירוק-פלורסנט) ו- propidium יודיד (אדום-פלורסנט) יכול לשמש עבור הבחנה חזותית בין חיידקים מתים וחיים28,29,30. Propidium יודיד חודר רק חיידקים עם ממברנות פגום, בעוד SYTO9 מזין תאים חיידקיים עם קרום שלמים ולא פרוץ. כאשר שני צבעי נמצאים בתוך תא, propidium יודיד יש זיקה גדולה יותר עבור חומצות גרעין ומביא SYTO9, סימונו אדום28,30.
על רקע הסביבה אוראלי המורכבות ואת אורלי biofilm הטרוגניות, מיקרוסקופיה טכניקות הדרושים המאפשרים ניתוח biofilm של המשטחים של שיניים, חומרים דנטליים. מאמר זה מתאר סדרה של פרוטוקולים ליישם לצורך השוואת ביופילמים אוראלי על טיטניום, חומרים קרמיים של התותבת abutments, כמו גם השיטות מעורב biofilms אוראלי ניתוחים ברמות הסלולר מורפולוגיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול המתוארים במחקר זה פותחה כדי להעריך את ביופילמים על חומרי טיטניום, אסתטיים abutments תותבות, כולל הניתוח של תא החיידק הכדאיות ומאפיינים מורפולוגי. כדי לבצע זאת, מודל ב באתרו של ביופילמים תוכנן, המורכב התקן אוראלית מסוגל להכיל דוגמיות של החומרים מבחן ולשמור אותם חשופים לסביבה אורא…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה חוסה אוגוסטו Maulin מן המעבדה באודות מיקרוסקופ (בית הספר לרפואה של ריבייראו פרטו) על עזרתו הנדיבה עם EDS, SEM ניתוחים ואת אחי מצ’אדו טיישיירה לסיוע טכני נדיב שלו במהדורה וידאו.
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
Riferimenti
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections – an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know?. Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness – an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms – An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O’Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
