Diş implantları için farklı malzemeler üzerinde sözlü biyofilm oluşumu
Summary
Burada, sözlü biyofilm oluşumu için diş protez ayakları bakteri hücreleri canlılığı ve morfolojik özellikleri analizi de dahil olmak üzere, titanyum ve zirkon malzemeler üzerinde değerlendirmek için bir protokol mevcut. Güçlü mikroskobu teknikleri ile ilişkili bir in situ modeli sözlü biyofilm analizi için kullanılır.
Abstract
Diş implantları ve protez bileşenlerinin bakteriyel kolonizasyon ve biyofilm oluşumu yatkındır. Düşük mikrobiyal yapışma sağlar malzeme kullanımı yaygınlığı ve peri-implant hastalıkların ilerlemesini azaltabilir. Sözlü ortamı karmaşıklığı ve oral biyofilm heterojenite görünümünde, diş ve Diş malzemeleri yüzeylerinin bir biyofilm analiz etkinleştirebilirsiniz teknikleri ihtiyaç vardır mikroskobu. Bu makalede, bir dizi sözlü biyofilm oluşumu titanyum ve protez ayakları için seramik malzemeler üzerinde yanı sıra sözlü biyofilmler analizleri, morfolojik ve hücresel düzeyde dahil yöntemleri karşılaştırmak için uygulanan protokol. Bu çalışmada açıklandığı gibi sözlü biyofilm oluşumu titanyum ve zirkon malzemeler için diş protez ayakları üzerinde değerlendirmek için situ modeli böylece metodolojik yeterliliği gösteren 48 h biyofilm tatmin edici bir koruma sağlar. Multiphoton mikroskobu numuneler üzerinde oluşan biyofilm bir alan temsilcisi analiz sağlar. Buna ek olarak, fluorophores kullanımı ve multiphoton mikroskobu kullanarak görüntü işleme bakteriyel canlılığı analiz mikroorganizmalar çok heterojen bir nüfusa sağlar. Elektron mikroskobu biyolojik numunelerin hazırlanması biyofilm, iyi görüntüler ve hiçbir yapıları yapısal korunması teşvik etmektedir.
Introduction
Bakteriyel biyofilmler karmaşıktır, işlevsel ve yapısal olarak mikrobiyal topluluklar düzenlenen, bir hücre dışı, biyolojik olarak aktif polimer matris1,2sentez mikrobiyal türlerin çeşitliliğinin tarafından karakterize. Bakteriyel yapışma sağlar biyotik veya abiyotik yüzeyleri çoğunlukla oluşan tükürük glikoproteinlerin1,3,4‘ alınan film tabakası oluşumu ile öncesinde. Mikroorganizmaların ve film tabakası arasındaki zayıf fizikokimyasal etkileşimler başlangıçta kurulan ve bakteriyel adhesins ve glikoprotein reseptörlerinin alınan film tabakası, daha güçlü Hofstede tarafından takip etti. Mikrobiyal çeşitlilik giderek artar ikincil sömürgecilerin reseptörleri zaten ekli bakteri oluşturan bir multispecies topluluk1,3,4, , coaggregation ile 5.
Sözlü microbiota ve ana bilgisayar ile simbiyotik ilişkisi homeostazı ağız sağlığı korunmasında önemlidir. Dysbiosis oral biyofilmler içinde çürük ve periodontal hastalık2,5gelişimi için risk artabilir. Klinik çalışmalar biyofilm diş veya diş implantları birikimi ve dişeti iltihabı veya peri-implant Mukozit6,7gelişimi neden-sonuç ilişkisi göstermektedir. Enflamatuar süreç ilerlemesini peri-implantitis ve implant8sonucu kaybına yol açar.
Diş implantları ve protez bileşenlerinin bakteriyel kolonizasyon ve biyofilm oluşumu9yatkındır. Kimyasal kompozisyon ve düşük mikrobiyal yapışma sağlar yüzey topografyası malzemelerin kullanımı yaygınlığı ve peri-implant hastalıkları9,10ilerlemesini azaltabilir. Titanyum implantlar için protez ayakları üretimi için en çok kullanılan malzemedir; Ancak, seramik malzemeler son zamanlarda kullanılmaya başlanan ve estetik özellikleri ve biyouyumluluk11,12nedeniyle titanyum alternatif olarak popülerlik kazanmaktadır. Da önemlisi, seramik malzemeler mikroorganizmaların, ana toprak dolay iden onların yüzey pürüzlülüğü, wettability ve yüzey serbest enerji10,13uymak için sözde azaltılmış bir potansiyel ile ilişkilendirilmiştir.
Vitro çalışmalar mikrobiyal yapışma anlayış önemli gelişmeler protez ayağına yüzeyler9,14,15,16,17katkıda bulunmuştur. Ancak, farklı sıcaklık ve pH ve besin durumu yanı sıra kesme kuvvetleri, varlığı ile karakterize ağız boşluğu dinamik çevre vitro deneysel protokoller18‘tekrarlanabilir değil, 19. Bu sorunu aşmak için bir alternatif in situ modelleri avantajlı ex vivo analiz10,20, , üç boyutlu yapısını korur biyofilm oluşumu kullanmaktır 21 , 22 , 23 , 24.
Sözlü yüzeylerde oluşan biyofilm karmaşık yapısını analiz mikroskobu teknikleri optik yoğun madde25görüntüleme kapasitesine sahip gerektirir. Multiphoton lazer mikroskobu tarama biyofilm yapısal analizi26için modern bir seçenektir. Doğrusal olmayan optik ile femtoseconds27ile Geniş puls kızılötesi dalga boyu, yakın bir aydınlatma kaynak kullanımı ile karakterizedir. Bu yöntem autofluorescence malzeme veya malzeme fluorophores, lineer olmayan optik sinyalleri ikinci harmonik üretimi bilinen bir fenomen türetilen tarafından oluşturulan görüntüler ek olarak işaretlenmiş resim alma için endikedir. Multiphoton mikroskobu avantajları arasında en düşük hücre hasarı uyarma ışık27yoğunluğu ile elde edilen büyük resim derinliğini olduğunu.
Biyofilm multiphoton mikroskobu tarafından abiyotik yüzeylerde canlılığı analizini, floresan nükleik asit kullanımı ile farklı spektral özellikleri Boyayıcılar ve bir penetrasyon bakteri hücreleri içinde gerekli28kapasitesidir. Fluorophores SYTO9 (yeşil-floresan) ve propidium iyodür (kırmızı-floresan) canlı ve ölü bakteriler28,29,30arasındaki görsel bir farklılaşma için kullanılabilir. SYTO9 sağlam ve güvenliği aşılan bir membran ile bakteri hücreleri girer iken Propidium iyodür hasarlı membranlar, tek bakteri nüfuz eder. Her iki boyalar bir hücre içinde bulunduğunda, propidium iyodür nükleik asitler için daha büyük bir ilgi vardır ve SYTO9, kırmızı28,30işaretleme displaces.
Sözlü ortamı karmaşıklığı ve oral biyofilm heterojenite görünümünde, diş ve Diş malzemeleri yüzeylerinin biyofilm analiz etkinleştirebilirsiniz teknikleri ihtiyaç vardır mikroskobu. Bu makalede, bir dizi sözlü biyofilm oluşumu titanyum ve protez ayakları için seramik malzemeler üzerinde yanı sıra sözlü biyofilmler analizleri, morfolojik ve hücresel düzeyde dahil yöntemleri karşılaştırmak için uygulanan protokol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada açıklanan protokol biyofilm oluşumu için protez ayakları bakteri hücre canlılığı ve morfolojik özellikleri analizi de dahil olmak üzere, titanyum ve zirkon malzemeler üzerinde değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bunu gerçekleştirmek için bir in situ modeli biyofilm oluşumu, test materyalleri örnekleri uyum ve 48 h dinamik ağız ortamına maruz kalmalarını bir intraoral cihaz oluşan tasarlanmıştır. Cihaz rahat ve basit-e doğru eklemek, kaldırmak ve temiz tarafında…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar EDS ve SEM onun cömert yardım için teşekkür ederiz José Augusto Maulin mikroskobu çok kullanıcılı laboratuvar (Tıp Fakültesi, Ribeirão Preto) üzerinden analizleri ve kardeşim Teixeira Machado için video sürüm onun cömert teknik yardım.
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
Riferimenti
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections – an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know?. Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness – an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms – An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O’Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
