Een flexibele goedkope hydrocultuur systeem voor de beoordeling van de Plant reacties op kleine moleculen onder steriele omstandigheden
Summary
Een eenvoudige, veelzijdige en goedkope in vitro hydrocultuur systeem werd met succes geoptimaliseerd, inschakelen van grootschalige experimenten onder steriele omstandigheden. Dit systeem vergemakkelijkt de toepassing van chemische stoffen in een oplossing en hun efficiënte absorptie door wortels voor moleculaire, biochemische en fysiologische studies.
Abstract
Een breed scala van studies in plantenbiologie zijn uitgevoerd met behulp van hydrocultuur culturen. In dit werk, wordt een in vitro hydrocultuur groei systeem ontworpen voor de beoordeling van de plant reacties op chemische stoffen en andere stoffen van belang gepresenteerd. Dit systeem is zeer efficiënte bij het verkrijgen van homogene en gezond pootgoed voor de C3 en C4 model soorten Arabidopsis thaliana en Setaria viridis, respectievelijk. De steriele teelt vermijdt algen en micro-organismen verontreiniging, waarvan bekend is dat beperkende factoren voor de normale groei van planten en de ontwikkeling in hydrocultuur. Bovendien is dit systeem schaalbaar, waardoor de oogst van plantaardig materiaal op grote schaal met kleine mechanische schade, evenals de oogst van afzonderlijke delen van een plant indien gewenst. Een gedetailleerd protocol aan te tonen dat dit systeem een eenvoudige en goedkope assemblage heeft, aangezien het pipet rekken als het belangrijkste platform gebruikt voor de teelt van planten, wordt verstrekt. De haalbaarheid van dit systeem werd gevalideerd met behulp van Arabidopsis zaailingen te beoordelen van het effect van de drug AZD-8055, een chemische inhibitor van het streefcijfer van rapamycin (TOR) kinase. TOR remming ontdekt efficiënt zo spoedig 30 min na de behandeling van een AZD-8055 in roots en shoots. Bovendien weergegeven AZD-8055-behandelde planten het verwachte zetmeel-overmaat fenotype. We voorgesteld dit hydrocultuur systeem als een ideale methode voor onderzoekers van de plant gericht op het controleren van de actie van de fabriek inductoren of remmers, evenals evalueren van metabole fluxen met behulp van isotopen-labeling verbindingen waarvoor, in het algemeen, het gebruik van dure reagentia.
Introduction
De voordelen van groeiende planten met behulp van hydrocultuur hebben algemeen erkend in de productie van grote uniforme planten en reproduceerbare experimenten1,2,3inschakelen. In dit systeem kan de compositie van de voedselkwaliiteit oplossing naar behoren wordt gecontroleerd en gerecycleerd langs alle stadia van plantengroei en ontwikkeling. Wortels zijn bovendien niet onderworpen aan de abiotische stress, zoals kan gebeuren in de bodem geteelde planten, zoals nutriënten honger en water deficiëntie4. Als planten gekweekt hydrocultuur aanwezig morfologische en fysiologische eigenschappen redelijk vergelijkbaar met degene die worden gekweekt in de bodem, dit systeem is in grote lijnen nog werkzaam zijn in onderzoek omdat het mogelijk de monitoring van wortel/schieten groei en hun oogsten maakt zonder verwondingen2,5.
Te wijten aan de mogelijkheid van het wijzigen van de samenstelling en de concentratie van de voedselkwaliiteit oplossing, is het meeste onderzoek met behulp van hydrocultuur voorwaarden verricht karakteriseren van de functies voor micro- en macronutriënten1,3 ,6,7,8. Nochtans, heeft dit systeem bleek zeer nuttig zijn voor een breed scala aan toepassingen in plantenbiologie, zodanig ophelderen van de functies van hormonen en chemische stoffen in planten. Bijvoorbeeld, de ontdekking van strigolactones als een nieuwe klasse van hormonen9 en het fenotype van de versnelde groei veroorzaakt door brassinosteroïde toepassing10 werden uitgevoerd onder hydrocultuur voorwaarden. Bovendien maakt dit systeem experimenten met gelabelde isotopen (b.v., 14N /15N en 13CO2)11,12 te evalueren hun opneming in de eiwitten en metabolieten door de Spectrometrie van de massa.
Gezien het belang van dit systeem in plantenonderzoek, een groot aantal hydrocultuur culturen is ontwikkeld in de afgelopen jaren, met inbegrip van systemen die gebruikmaken van (i) de overdracht van zaailingen uit platen met hydrocultuur containers3, 13; (ii) rockwool dat beperkt de toegang tot de vroege stadia van wortel ontwikkeling2,14,15; (iii) polyethyleen granulaat als het zwevende lichaam, waardoor de homogene toepassing van kleine moleculen/behandelingen moeilijk16; of (iv) een verminderd aantal planten9,17. Het volume van hydrocultuur tanks beschreven in veel van deze protocollen zijn meestal grote (kleine hoeveelheden variërend van 1-5 L, maximaal 32 L)18, waardoor de toepassing van chemische stoffen extreem duur. Hoewel weinig studies een hydrocultuur teelt onder aseptische condities8,beschrijven is19, de vergadering van het systeem meestal heel moeizaam, bestaande uit de perfecte aanpassing van nylon mazen in plastic of glas containers5,8,17,20.
Vanwege het belang van Arabidopsis thaliana als een model-plant, werden de meerderheid van hydrocultuur systemen ontworpen voor dit soort1,2,8,14,18, 19 , 20. niettemin, er zijn een paar studies rapportagefuncties de hydrocultuur groei van andere plantensoorten met een voorbehandeling van zaden ter verbetering van hun kiemkracht en synchronisatie tarieven in vitro8,16 . Om te kunnen werken op grote schaal, ontwikkelden we een protocol voor het opzetten van een eenvoudige en goedkope hydrocultuur onderhoudssysteem waarmee steriele omstandigheden voor de teelt van planten, met inbegrip van A. thaliana en andere soorten, zoals het gras Setaria viridis. De hier beschreven methode is geschikt voor verschillende experimenten, zoals de zaailing groei kan worden gemaximaliseerd, gesynchroniseerd en gemakkelijk gecontroleerd. Bovendien, dit systeem heeft vele voordelen als: (i) de montage is eenvoudig en de componenten ervan kunnen worden hergebruikt; (ii) hierdoor de gemakkelijke toepassing van verschillende chemische stoffen in de vloeistof; (iii) de zaailingen ontkiemen en groeien rechtstreeks in het kweekmedium zonder de behoefte aan overdracht aan de hydrocultuur systeem; (iv) de shoot en wortel ontwikkeling/groei nauw kunnen worden gecontroleerd en de zaailingen worden geoogst zonder schade; en (v) het maakt het mogelijk om te werken op grote schaal, behoud van fysiologische toestanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze geoptimaliseerde hydrocultuur structuur maakt het mogelijk de succesvolle in vitro cultuur van planten. Zaden ontkiemen goed op de solide medium op de pipet tip plat oppervlak, een aanzienlijke winst in vergelijking met systemen waar zaden doorweekt met de voedingsoplossing zijn. Een groot voordeel van dit systeem is dat tijdens de ontwikkeling van zaailing, wortels rechtstreeks contact met de vloeistof zonder de behoefte aan overdracht krijgen. Bovendien, chemische behandeling kan gemakkelijk worden toegep…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de São Paulo Research Foundation (FAPESP; Verlenen van 12/19561-0) en de Max-Planck-Gesellschaft. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), en Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) zijn dankbaar voor de beurzen. De auteurs bedanken Christian Meyer van het Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Frankrijk) royaal voorzien van antilichamen tegen RPS6. De auteurs bedanken RTV UNICAMP en Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel voor hun technische ondersteuning tijdens het geluid opnemen.
Materials
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
Riferimenti
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
- Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
- Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
- Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
- Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
- Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
- Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
- Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O., Asao, T. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. , 135-152 (2012).
- Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
- Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
- Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
- Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
- Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
- Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
- Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
- Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
- Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
- Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
- Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
- Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
- Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W., Fleischer, S., Fleischer, B. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. 174, 518-552 (1989).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR?. Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
- Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
- Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
- Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
- Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
- Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
- Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
- Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
- Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
- Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
- Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
- Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
- Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
- Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
- Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
- Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
- Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
- Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
- Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
