JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ambiente

Küçük moleküllere steril koşullarda bitki yanıt-e doğru değerlendirmek için Hydroponic sistemi esnek bir düşük maliyetli

Published: August 25, 2018
doi:
10.3791/57800
, , , , , ,
1Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE),Brazilian Center for Research in energy and materials (CNPEM), 2University of Campinas (UNICAMP), 3University of Viçosa (UFV), 4CTBE,CNPEM, 5Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE/CNPEM),Max Planck Partner Group

Summary

Basit, çok yönlü ve düşük maliyetli vitro hydroponic sistemi başarılı bir şekilde, Steril koşullar altında büyük ölçekli deneyler etkinleştirme optimize edildi. Bu sistem bir çözüm ve moleküler, biyokimyasal ve fizyolojik çalışmalar için kökleri tarafından verimli kendi emilimi kimyasal uygulama kolaylaştırır.

Abstract

Çok çeşitli bitki biyoloji çalışmalarda hydroponic kültürler kullanarak gerçekleştirilir. Bu çalışmada, bir vitro hydroponic büyüme sistemi bitki yanıt kimyasallar ve diğer maddelerin ilgi değerlendirmek için tasarlanmış sunulmaktadır. Bu sistem sırasıyla C3 ve C4 modeli tür Arabidopsis thaliana ve Setaria viridis, homojen ve sağlıklı fide elde etmek son derece etkilidir. Steril ekimi yosun ve mikroorganizma kirlenme, normal büyüme ve Kalkınma suda sınırlayan faktörler bilinen önler. Ayrıca, bu sistem bitki materyali ufak mekanik hasar ile büyük bir ölçekte hasat, hem de tek tek parçaları bir bitkinin hasat istenirse etkinleştirme ölçeklenebilir yapıdadır. Bu pipet rafları için büyüyen bitkiler, ana platformu olarak kullanır gibi bu sistemi kolay ve düşük maliyetli bir derleme, sahip olduğunu gösteren ayrıntılı bir protokol sağlanır. Bu sistemin fizibilite uyuşturucu AZD-8055, rapamycin (TOR) kinaz hedefinin kimyasal bir önleyici etkisini değerlendirmek için Arabidopsis fidan kullanılarak doğrulandı. TOR inhibisyon verimli roots ve shoots bir AZD-8055 tedavi sonrası erken 30 dk olarak algılandı. Ayrıca, AZD 8055 tedavi bitkiler beklenen nişasta-aşırı fenotip görüntülenir. Biz metabolik Cereyanlar, genel olarak, pahalı kullanımını gerektirir izotop etiketleme bileşikleri kullanarak değerlendirmek için bitki indükleyicileri veya inhibitörleri, de eylem izlemek için amaçlayan bitki araştırmacılar için ideal bir yöntem olarak bu hydroponic sistemi önerilen reaktifler.

Introduction

Büyüyen bitkiler hydroponics kullanarak avantajları büyük ve düzgün bitkiler, tekrarlanabilir deneyleri1,2,3etkinleştirme üretiminde yaygın olarak kabul edilmiştir. Bu sistemde besin çözüm bileşimi olabilir düzgün kontrollü ve bitki büyüme ve gelişmesi tüm aşamaları geri dönüştürülmüş. Ayrıca, kökleri için abiyotik stresleri, toprak-yetiştirilen bitkiler, besin açlık ve su eksikliği4gibi olabilir tabi değil. Kök/ateş büyüme ve onların olmadan hasat izlenmesi verdiğinden hydroponically mevcut morfolojik ve fizyolojik özellikleri oldukça benzeyen kültürlü toprakta yetişen bitkiler bu sistem geniş araştırma istihdam edilmiştir yaralanma2,5.

Kompozisyon ve besin çözüm konsantrasyonu değiştirme olasılığı nedeniyle, hydroponic koşullar kullanarak araştırma çoğunu gerçekleştirilen mikro – macronutrients1,ve3 işlevleri tanımlamak için ,6,7,8. Ancak, bu sistem çok geniş bir bitki biyolojisi, hormonlar ve kimyasallar bitkilerde işlevleri aydınlatmak gibi uygulamalarda yararlı olduğunu kanıtlamıştır. Örneğin, strigolactones, hormonlar9 ve brassinosteroid uygulama10 tarafından tetiklenen hızlandırılmış büyüme fenotip yeni bir sınıf olarak keşfi hydroponic koşullar altında gerçekleştirilen. Ayrıca, bu sistem ile etiketlenmiş izotoplar deneyler sağlar (Örneğin, 14N /15N ve 13CO2) protein ve metabolitleri içine onların birleşme değerlendirmek için11,12 Kütle spektrometresi tarafından.

Bu sistemde bitki araştırmaları önemi göz önüne alındığında, hydroponic kültürler yüksek sayıda tasarlanmıştır (i) aktarım hydroponic konteyner3, için plakalar üzerinden fidan kullanan sistemler dahil olmak üzere son birkaç yıl içinde 13; (ii) kök gelişimi2,14,15erken dönemlerinde erişimi sınırlar Taşyünü; (iii) Polietilen granül küçük moleküller/bakımları zor16homojen uygulama yapar kayan gövdesi olarak; veya (iv) azaltılmış bir numarası bitkiler9,17. Bu protokoller çoğunda açıklanan hydroponic tank hacmi genellikle büyük (1-5 L–dan 32 L kadar değişen küçük birimler)18kimyasalların uygulanması son derece pahalı hale getirir,. Her ne kadar birkaç çalışmalar aseptik koşullar8,altında bir hydroponic ekimi tarif19, sistem derleme genellikle oldukça zahmetli, naylon kafesler içine plastik ya da cam mükemmel uyum oluşan Konteyner5,8,17,20.

Bir modeli tesisi olarak Arabidopsis thaliana önemi nedeniyle, bu tür1,2,8,14,için18, hidroponik sistemleri çoğunluğu tasarlanmıştır 19 , 20. Bununla birlikte, birkaç çalışma raporlama onların çimlenme geliştirmek için tohumları Önarıtma ile diğer bitki türlerinin hydroponic büyüme özellikleri vardır ve eşitleme oranları vitro8,16 . A. thaliana ve ot Setaria gibi diğer türler de dahil olmak üzere bitki yetiştirme için steril koşullar sağlayan bir basit ve düşük maliyetli bakım hydroponic sistemi kurma için bir protokol geliştirdiğimiz büyük ölçüde çalışmak için viridis. Fide büyüme ekranı, senkronize ve kolayca takip gibi yöntem tanımlamak burada farklı deneyler için uygundur. Ayrıca, bu sistem olarak pek çok avantajı vardır: (i) onun derleme basittir ve bileşenlerini yeniden kullanılabilir; (ii) Bu sıvı orta içine farklı kimyasal uygulama kolaylığı sağlar; (iii) fidan çimlenme ve doğrudan kültür orta aktarım, gerek kalmadan hidroponik sistem büyümek; (iv çekim ve kök gelişimi/büyüme yakından nezaret etmek ve fidan hasar hasat; ve (v) bu mümkün kılan büyük ölçüde, çalışmak fizyolojik şartlarda sürdürmek.

Protocol

1. sıvı ve katı Kültür medya hazırlanması Yarı güçte Murashige ve Skoog (MS) orta vitaminleri ile [0.0125 mg/L cobalt(II) klorür pentahydrate, 0.0125 mg/L copper(II) sülfat pentahydrate, 18,35 mg/L ethylenediaminetetraacetate ferrik sodyum, 3.10 mg/L kullanarak sıvı bir ortam hazırlamak Borik asit, potasyum iyodür, 8,45 mg/L manganez 0.415 mg/L sülfat monohidrat, 0,125 mg/L sodyum molibdat dihydrate, 4.30 mg/L çinko sülfat heptahydrate, 166.01 mg/L kalsiyum klorür, potasyum dihydrogen fosfat…

Representative Results

TOR kinaz besin ve enerji hücre çoğalması ve büyüme tüm ökaryotlarda tanıtmak sinyal entegre büyük bir düzenleyicisidir. Çabaları TOR işlevleri tesislerinde aydınlatmak için TOR koşullu baskı RNA müdahale veya yapay mikroRNA28,30,31aracılığıyla içeren Arabidopsis transgenik satırların nesil içerir, embriyo öldürücü fenotip TOR nakavt bitkiler<sup class="xr…

Discussion

Bu en iyi duruma getirilmiş hydroponic yapı başarılı vitro kültür bitkilerin sağlar. Tohum çimlenme su kuyusu üstünde pipet ucu düz yüzey sağlam orta, tohum ile besin çözüm batırılmış nerede sistemleri ile karşılaştırıldığında önemli bir kazanç. Bu sistemin büyük bir avantaj fide geliştirme sırasında sıvı orta aktarım, gerek kalmadan doğrudan temas kökleri elde edilmesi. Ayrıca, kimyasal arıtma azaltılmış bir hacim içinde sıvı ortamda kolayca uygulanabilir. Nem or…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser São Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP; tarafından desteklenen 12/19561-0 vermek) ve Max Planck toplum. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), ve Viviane C. H. da Silva (burunları/CNPEM 24/2013) arkadaş grupları için müteşekkiriz. Yazarlar Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Fransa) Christian Meyer cömertçe RPS6 karşı antikor verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar RTV UNICAMP teşekkür ve Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel ses sırasında teknik destek için kayıt.

Materials

Ethanol Merck 100983
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Polysorbate 20   Sigma-Aldrich P2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins  Duchefa Biochemie M0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate Duchefa Biochemie M1503
Agar  Sigma-Aldrich A7921
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 484016
Laminar flow hood Telstar BH-100
Hotplate AREC F20510011
Growth chamber Weiss Technik HGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) Uniglass 189.006
200 μL pipette tip racks  Kasvi K8-200-5 *
300 μL multichannel pipette Eppendorf 3122000060
300 μL pipette tips Eppendorf 30073088
200 μL pipette  Eppendorf 3120000054
200 μL pipette tips Eppendorf 30000870
Scissors Tramontina 25912/108
Tweezer ABC Instrumentos 702915
Scalpel blade Sigma-Aldrich S2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m) Scotch 3M 5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) Maxipac 32771
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
  2. Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
  3. Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
  4. Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
  5. Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
  6. Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
  7. Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
  8. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
  9. Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
  10. Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
  11. Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
  12. Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
  13. Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O., Asao, T. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. , 135-152 (2012).
  14. Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
  15. Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
  16. Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
  17. Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
  18. Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
  19. Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
  20. Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
  21. Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
  22. Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
  23. Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
  24. Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
  25. Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
  26. Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
  27. Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W., Fleischer, S., Fleischer, B. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. 174, 518-552 (1989).
  28. Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
  29. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  30. Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR?. Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
  31. Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
  32. Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
  33. Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
  34. Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
  35. Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
  36. Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
  37. Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
  38. Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
  39. Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
  40. Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
  41. Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
  42. Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
  43. Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
  44. Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
  45. Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
  46. Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
  47. Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
  48. Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
  49. Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  50. Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
  51. Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
  52. Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
  53. Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
  54. Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
  55. Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
  56. Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
  57. Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).

Tags

Keywords: Hydroponic SystemIn VitroSterile ConditionsPlant ResponsesSmall MoleculesArabidopsis ThalianaMS MediumLaminar Flow HoodSterilizationUV LightSolid MediumLiquid Medium
check_url/it/57800?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Monte-Bello, C. C., Araujo, E. F., Martins, M. C., Mafra, V., da Silva, V. C., Celente, V., Caldana, C. A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions. J. Vis. Exp. (138), e57800, doi:10.3791/57800 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image