Eine Flexible Low-Cost-Hydrokultur-System für die Bewertung der Pflanze Antworten auf kleine Moleküle unter sterilen Bedingungen
Summary
Eine einfache, vielseitige und preisgünstige in-vitro- Hydrokultur-System wurde erfolgreich optimiert und ermöglichen umfangreiche Experimente unter sterilen Bedingungen. Dieses System erleichtert die Anwendung von Chemikalien in einer Lösung und deren effiziente Absorption von Wurzeln für molekularen, biochemischen und physiologischen Studien.
Abstract
Eine Vielzahl von Studien in Pflanzenbiologie werden mit hydroponischen Kulturen durchgeführt. In dieser Arbeit wird ein in-vitro- Hydroponische Wachstum System für die Bewertung der Pflanze Reaktionen auf Chemikalien und anderen Stoffen von Interesse vorgestellt. Dieses System ist höchst effizient in homogenen und gesunde Setzlinge der C3 und C4 Modell Spezies Arabidopsis Thaliana und Setaria Viridis, bzw. zu erhalten. Der sterile Anbau vermeidet Algen und Mikroorganismen Kontamination, die limitierende Faktoren für Anlage normales Wachstum und Entwicklung in Hydrokultur bekannt sind. Darüber hinaus ist dieses System skalierbar, ermöglicht die Ernte von Pflanzenmaterial in großem Maßstab mit kleinere mechanische Schäden als auch die Ernte der einzelnen Teile einer Pflanze, falls gewünscht. Ein detailliertes Protokoll zeigt, dass dieses System verfügt über eine einfache und kostengünstige Montage, da sie Pipette Racks als wichtigste Plattform verwendet für den Anbau von Pflanzen, steht zur Verfügung. Die Durchführbarkeit dieses Systems war mit Arabidopsis Sämlinge zur Beurteilung der Wirkung des Medikaments AZD-8055, eine chemische das Ziel von Rapamycin (TOR)-Kinase-Inhibitor validiert. TOR-Hemmung wurde effizient so früh wie 30 min nach einer AZD-8055-Behandlung in Wurzeln und Triebe erkannt. Darüber hinaus angezeigt AZD-8055-behandelten Pflanzen den erwarteten Stärke-Überschuss-Phänotyp. Wir diese Hydrokultur-System als eine ideale Methode für Pflanzenforscher mit dem Ziel, die Wirkung der Pflanze Induktoren oder Inhibitoren, sowie zu überwachen, bewerten metabolischen Flüsse mit Isotopen-Kennzeichnung Verbindungen, die in der Regel erfordert die Verwendung von teuren vorgeschlagen Reagenzien.
Introduction
Die Vorteile der Verwendung von Hydrokultur Pflanzen haben in der Produktion von großen und einheitliche Pflanzen ermöglichen reproduzierbare Experimente1,2,3weithin anerkannt. In diesem System kann die Zusammensetzung der Nährlösung ordnungsgemäß kontrolliert und recycelt alle Stufen von Wachstum und Entwicklung. Darüber hinaus sind Wurzeln nicht abiotischen Belastungen ausgesetzt, wie im Boden gewachsen Pflanzen, wie Nährstoff Hunger und Wasser-Mangel4auftreten können. Als Pflanzen hydroponisch vorliegende morphologische und physiologische Eigenschaften ziemlich ähnlich denen in Erde kultiviert hat dieses System im großen und ganzen in der Forschung tätig weil es erlaubt, die Überwachung der Wurzel/Sprosswachstum und ihre Ernte ohne Verletzungen2,5.
Aufgrund der Möglichkeit der Änderung der Zusammensetzung und Konzentration von der Nährlösung der Großteil der Forschung mit Hydrokultur Bedingungen durchgeführt wurde, um die Funktionen von Mikro- und Makronährstoffen1,3 charakterisieren ,6,7,8. Allerdings hat dieses System erwies sich als sehr nützlich, um ein breites Anwendungsspektrum in Pflanzenbiologie, wie die Funktionen von Hormonen und Chemikalien in Pflanzen aufzuklären. Zum Beispiel wurden die Entdeckung des Strigolactones als eine neue Klasse von Hormonen9 und der beschleunigten Wachstums Phänotyp ausgelöst durch Brassinosteroid Anwendung10 Hydrokultur Bedingungen durchgeführt. Darüber hinaus ermöglicht dieses System Experimente mit beschrifteten Isotope (z.B., 14N /15N und 13CO2)11,12 , deren Eingliederung in Proteinen und Metaboliten zu bewerten durch Massenspektrometrie.
In Anbetracht der Bedeutung dieses Systems in der Pflanzenforschung, eine hohe Anzahl von hydroponischen Kulturen wurde in den letzten Jahren, einschließlich Systeme, mit denen (i) die Übertragung der Sämlinge aus Platten auf Hydrokultur Container3, 13; (Ii) Rockwool, die Zugang zu den frühen Stadien der Wurzel Entwicklung2,14,15begrenzt; (Iii) Polyethylen-Granulat als Schwimmkörper, wodurch die einheitliche Anwendung der kleinen Moleküle/Behandlungen schwierig16; oder (iv) eine reduzierte Anzahl von Pflanzen9,17. Das Volumen der Hydrokultur Panzer beschrieben in vielen dieser Protokolle sind in der Regel groß (kleine Volumen von 1-5 L, bis zu 32 L)18, die die Anwendung von Chemikalien extrem teuer macht. Obwohl einige Studien eine Hydrokultur unter aseptischen Bedingungen8,beschreiben ist19, die Montage des Systems in der Regel ziemlich mühsam, bestehend aus die perfekte Abstimmung von Nylon Maschen in Kunststoff oder Glas Container5,8,17,20.
Wegen der Bedeutung als Modellpflanze Arabidopsis Thaliana wurden die Mehrheit der Hydroponik-Systeme für diese Arten1,2,8,14,18, entwickelt. 19 , 20. Dennoch gibt es einige Studien, die die Hydroponische Wachstum Berichtsfunktionen anderer Pflanzenarten mit eine Vorbehandlung der Samen ihre Keimfähigkeit zu verbessern und Synchronisation Preise in-vitro-8,16 . Um im großen Maßstab zu arbeiten, entwickelten wir ein Protokoll für eine einfache und kostengünstige Wartung Hydrokultur-System, mit dem sterile Bedingungen für den Anbau von Pflanzen, darunter A. Thaliana und andere Arten, wie der Rasen Setaria kann einrichten Viridis. Die hier beschriebene Methode eignet sich für verschiedene Experimente, wie das Wachstum des Keimlings maximiert, synchronisiert und leicht überwacht werden kann. Dieses System hat viele Vorteile wie: (i) die Montage ist unkompliziert und seiner Komponenten wiederverwendet werden; (Ii) es ermöglicht die einfache Anwendung von verschiedenen Chemikalien in das flüssige Medium; (Iii) die Sämlinge Keimen und wachsen direkt in das Kulturmedium ohne die Notwendigkeit der Übertragung der Hydrokultur-System; (iv) das schießen und Wurzel Entwicklung/Wachstum eng überwacht werden können und die Keimlinge geerntet werden, ohne Schäden; und (V) es macht es möglich, auf einer großen Skala arbeiten Aufrechterhaltung der physiologischen Bedingungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese optimierte Hydrokultur Struktur ermöglicht die erfolgreiche in-vitro- Kultur von Pflanzen. Die Samen keimen gut auf festem Medium an der Pipette Spitze flache Oberfläche, ein erheblicher Gewinn im Vergleich zu Systemen, wo die Samen mit der Nährlösung getränkt sind. Ein großer Vorteil dieses Systems ist, dass während der Sämling-Entwicklung, Wurzeln direkt in Kontakt mit dem flüssigen Medium ohne die Notwendigkeit der Übertragung. Darüber hinaus kann chemischer Behandlung leicht in das flüssige…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Forschungsgemeinschaft von São Paulo (FAPESP; Gewähren Sie 12/19561-0) und der Max-Planck-Gesellschaft. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14-3/10407), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), und Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) sind dankbar für die Stipendien. Die Autoren danken für die großzügige Bereitstellung von Antikörpern gegen RPS6 Christian Meyer vom Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Frankreich). Die Autoren danken RTV UNICAMP und Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel für ihre technische Unterstützung während der Audio aufzeichnen.
Materials
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
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