עלות נמוכה גמיש מערכת הידרופונית להערכת תגובות צמח מולקולות קטנות בתנאים סטריליים
Summary
מערכת פשוטה רב-תכליתי, בעלות נמוכה במבחנה הידרופוני בהצלחה אופטימלי, הפעלת ניסויים בקנה מידה גדול בתנאים סטריליים. מערכת זו מקלה על היישום של חומרים כימיים פתרון וספיגה יעילה שלהם על ידי השורשים ללימודי מולקולרית, ביוכימיה ו פיזיולוגיים.
Abstract
מגוון רחב של לימודי בביולוגיה צמח מבוצעות באמצעות תרביות הידרופוני. בעבודה זו, מוצג במבחנה גידול הידרופוני מערכת המיועדת הערכת התגובות מפעל כימיקלים וחומרים אחרים עניין. מערכת זו היא היעילה ביותר בהשגת שתילים הומוגנית ובריא של C3 ו- C4 דגם מינים תודרנית לבנה , זיפן דגולה, בהתאמה. טיפוח סטרילי מונע אצות וזיהום מיקרואורגניזם, אשר ידועים גורמים מגבילים צמח רגיל לצמיחה ופיתוח בהידרופוניקה. בנוסף, מערכת זו היא מדרגית, המאפשר את היבול של חומר צמחי בקנה מידה גדול עם נזקים מכניים קלים, כמו גם את היבול של חלקים נפרדים של צמח במידת הצורך. פרוטוקול מפורט הוכחת כי מערכת זו יש הרכבה קלה, בעלות נמוכה, כפי שהיא משתמשת פיפטה מתלים כפלטפורמה העיקרי לגידול צמחים, מסופק. הכדאיות של מערכת זו אומתה באמצעות תודרנית השתילים כדי להעריך את ההשפעה של הסם AZD-8055, מעכב כימי של היעד של קינאז rapamycin (טור). טור עיכוב ביעילות זוהה מוקדם ככל 30 דקות לאחר טיפול AZD-8055 ב רוטס & שוטס. יתר על כן, צמחים AZD 8055-שטופלו מוצגים על פנוטיפ עמילן-עודף הצפוי. הצענו מערכת הידרופוני זו כמו שיטת אידיאלי עבור חוקרי הצמחים במטרה לפקח על הפעולה של הצמח inducers או מעכבי, כמו גם באשר להעריך פלקסים מטבולית באמצעות תיוג-איזוטופ תרכובות אשר, באופן כללי, מחייב שימוש יקר ריאגנטים.
Introduction
היתרונות של שימוש הידרופוניקה גידול צמחים זוהו נרחב בייצור של צמחים גדולה ואחידה, הפעלת ניסויים לשחזור1,2,3. במערכת זו, ההרכב של הפתרון התזונתי יכול להיות כראוי נשלטים ועל ממוחזר לאורך כל שלבי התפתחות וצמיחה של הצמח. יתר על כן, שורשים לא נתון והאביוטיים מושם, כפי שעלול לקרות בצמחים שגודלו בקרקע, כגון חומר מזין הרעבה ומים מחסור4. כמו הצמחים גדלו hydroponically נוכח פיזיולוגיים מורפולוגיים תכונות דומים למדי לאלו תרבותי בקרקע, מערכת זו כבר בהרחבה מועסקים במחקר כי זה מאפשר פיקוח על צמיחה שורש/לירות קצירת שלהם מבלי פציעות2,5.
בשל האפשרות של שינוי הרכב ואת ריכוז של הפתרון התזונתי, רוב המחקרים שימוש בתנאים הידרופוני בוצעה כדי לאפיין את הפונקציות של מיקרו – ו macronutrients1,3 ,6,7,8. עם זאת, מערכת זו הוכיחה להיות מאוד שימושי למגוון רחב של יישומים בביולוגיה הצמח, כגון להבהיר את הפונקציות של הורמונים וכימיקלים בצמחים. כך למשל, גילוי סטריגולקטונים כמו סוג חדש של הורמונים9 ו של פנוטיפ הצמיחה המואצת המופעלות על-ידי יישום ברסינוסטרואיד10 בוצעו בתנאים הידרופוני. יתר על כן, מערכת זו מאפשרת ניסויים עם איזוטופים שכותרתו (למשל, 14N /15N ו- 13CO2)11,12 להעריך שלהם שהשתלבה חלבונים ו מטבוליטים באמצעות ספקטרומטר מסה.
בהתחשב החשיבות של מערכת זו במחקר הצמח, מספר גבוה של תרבויות הידרופוני תוכנן בהשנים האחרונות, כולל מערכות המשתמשות (i) את ההעברה של שתילים של פלטות מיכלי הידרופוני3, 13; (ii) rockwool המגבילים גישה בשלבים המוקדמים של שורש פיתוח2,14,15; (iii) פוליאתילן מגרסת כמו הגוף צף, מה שהופך את היישום הומוגנית של מולקולות קטנות/טיפולים קשה16; או (iv) מופחתת מספר צמחים9,17. הנפח של טנקים הידרופוני תיאר ברבות מן הפרוטוקולים האלו הם בדרך כלל גדולים (אחסון קטן הנע בין 1-5 L, עד 32 L)18, מה שהופך את היישום של כימיקלים יקר מאוד. למרות מחקרים מעטים לתאר ההידרופוניות תחת תנאים aseptic8,19, ההרכבה של המערכת בדרך כלל די מייגעת, המורכב ההתאמה המושלמת של רשתות שינוי ניילון פלסטיק או זכוכית מכולות5,8,17,20.
בשל החשיבות של תודרנית לבנה כמו צמח מודל, הרוב המכריע של הידרופוניקה מערכות תוכננו עבור זה מינים1,2,8,14,18, 19 , 20. עם זאת, ישנם כמה מחקרים דיווח התכונות גידול הידרופוני מיני צמחים אחרים עם רעלני של זרעים לשפר את הנביטה שלהם ומחשיבה סינכרון במבחנה8,16 . כדי לעבוד בקנה מידה גדול, פיתחנו פרוטוקול עבור הגדרת מערכת הידרופוני תחזוקה פשוטה, בעלות נמוכה המאפשר בתנאים סטריליים לגידול צמחים, כולל לבנה א ו מינים אחרים, כגון הדשא זיפן דגולה. השיטה המתוארת כאן מתאימה לניסויים שונים, ככל הגידול שתיל יכול להיות מוגדל, מסונכרנים, בקלות תחת פיקוח. יתר על כן, מערכת זו יש יתרונות רבים כמו: (i) על מנת להרכיב וסופן ולהשתמש מרכיביו; (ii) זה מאפשר את יישום קל של כימיקלים שונים לתוך המדיום הנוזלי; (iii) את השתילים לנבוט ולגדול ישירות בהמדיום תרבות ללא הצורך של העברה אל מערכת הידרופוניקה; (iv) לירות ושורש הפיתוח/הגידול יכול להיות תחת פיקוח צמוד, השתילים נקצרים ללא פיצויים; ו (v) זה עושה את זה אפשרי לעבודה בקנה מידה גדול, שמירה על מצבים פיזיולוגיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מבנה הידרופוני ממוטבת זה מאפשר התרבות מוצלחת במבחנה של צמחים. הזרעים לנבוט על המדיום מוצק על משטח שטוח של עצה פיפטה, רווח ניכר לעומת מערכות איפה זרעים רטובים עם הפתרון התזונתי. יתרון גדול של השיטה היא כי במהלך הפיתוח שתיל, שורשים לקבל ישירות עם המדיום הנוזלי ללא הצורך של העברה. יתר על כ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן מחקר סאו פאולו (FAPESP; להעניק 12/19561-0), אגודת מקס פלאנק. אליאס פ Araújo (FAPEMIG 14/30594), קרולינה ג מונטה בלו (FAPESP; Mafra גרנט 14/10407-3), Valéria (FAPESP; גרנט 14/07918-6), ו- Viviane ג ה דה סילבה (גלימות/CNPEM 24/2013) אסירי תודה על המלגות. המחברים מודים כריסטיאן מאייר מ אינסטיטוט ז’אן פייר Bourgin (INRA, ורסאי, צרפת) על בנדיבות מתן נוגדנים נגד RPS6. המחברים תודה RTV UNICAMP והקלטת אד פאולו Aparecido de Souza מנואל לתמיכה טכנית שלהם במהלך השמע.
Materials
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
Riferimenti
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
- Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
- Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
- Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
- Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
- Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
- Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
- Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O., Asao, T. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. , 135-152 (2012).
- Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
- Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
- Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
- Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
- Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
- Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
- Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
- Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
- Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
- Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
- Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
- Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
- Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W., Fleischer, S., Fleischer, B. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. 174, 518-552 (1989).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR?. Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
- Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
- Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
- Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
- Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
- Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
- Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
- Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
- Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
- Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
- Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
- Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
- Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
- Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
- Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
- Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
- Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
- Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
- Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
