Um flexível baixo custo sistema hidropônico para avaliar as respostas de planta para pequenas moléculas em condições estéreis
Summary
Um sistema hidropónico simples, versátil e baixo custo em vitro foi otimizado com sucesso, possibilitando experiências em grande escala, sob condições estéreis. Este sistema facilita a aplicação de produtos químicos em uma solução e sua eficiente absorção pelas raízes para estudos moleculares, bioquímicas e fisiológicas.
Abstract
Uma vasta gama de estudos em biologia vegetal são executadas utilizando culturas hidropônicas. Neste trabalho, é apresentado um sistema hidropônico crescimento em vitro concebido para avaliar as respostas de fábrica de produtos químicos e outras substâncias de interesse. Este sistema é altamente eficiente na obtenção de mudas saudáveis e homogêneas do C3 e C4 modelo espécies Arabidopsis thaliana e Setaria viridis, respectivamente. O cultivo estéril evita algas e contaminação de microorganismos, que são conhecidos fatores limitantes para o crescimento normal da planta e desenvolvimento em hidroponia. Além disso, este sistema é escalável, permitindo a colheita de material vegetal em grande escala com pequenos danos mecânicos, bem como a colheita de peças individuais de uma planta, se desejado. Um protocolo detalhado, demonstrando que este sistema tem uma montagem fácil e de baixo custo, como ele usa a pipeta cremalheiras como a plataforma principal para o cultivo de plantas, é fornecido. A viabilidade deste sistema foi validada utilizando mudas de Arabidopsis para avaliar o efeito da droga AZD-8055, um inibidor químico do alvo da rapamicina (TOR) quinase. Inibição de TOR eficientemente foi detectada logo em 30 min depois de um tratamento de AZD-8055 em raízes e brotos. Além disso, plantas de AZD-8055-tratados exibido o fenótipo de amido-excesso esperado. Propusemos este sistema hidropónico como um método ideal para pesquisadores de planta com o objetivo de monitorar a ação da planta indutores ou inibidores, bem como avaliar fluxos metabólicos usando isótopos-rotulagem compostos que, em geral, requer o uso de caro reagentes.
Introduction
As vantagens de crescer plantas usando hidroponia tem sido amplamente reconhecidas na produção de plantas grandes e uniformes, possibilitando experiências reprodutíveis1,2,3. Neste sistema, a composição da solução nutritiva pode ser adequadamente controlada e reciclada ao longo de todas as fases de desenvolvimento e crescimento das plantas. Além disso, as raízes não estão sujeitos ao estresse abiótico, como pode acontecer em plantas de solo cultivado, como nutriente fome e água deficiência4. Como as plantas crescidas hydroponically presentes morfológicas e fisiológicas características bastante semelhantes da cultivadas no solo, este sistema tem sido amplamente empregado em pesquisa porque permite o acompanhamento do crescimento da raiz/fotografar e sua colheita sem lesões de2,5.
Devido à possibilidade de alterar a composição e a concentração da solução nutritiva, a maioria da pesquisa usando condições hidropônicas tem sido realizado para caracterizar as funções de micro e macronutrientes1,3 ,6,7,8. No entanto, este sistema provou para ser muito útil para uma ampla gama de aplicações em biologia vegetal, tal como para elucidar as funções dos hormônios e substâncias químicas em plantas. Por exemplo, a descoberta de estrigolactonas como uma nova classe de hormônios9 e o fenótipo de crescimento acelerado, desencadeada por brassinosteroid aplicação10 foram realizadas em condições hidropônicas. Além disso, este sistema permite experimentos com isótopos rotulados (por exemplo, 14N /15N e 13CO2)11,12 , para avaliar sua incorporação de proteínas e metabólitos por espectrometria de massa.
Considerando a importância deste sistema na pesquisa da planta, foi projetado um elevado número de culturas hidropônicas nos últimos anos, incluindo sistemas que usam a (i) a transferência de mudas de placas para recipientes hidropônico3, 13; (ii) rockwool que limita o acesso aos estágios iniciais de desenvolvimento do raiz2,14,15; (iii) polietileno granulado como o corpo flutuante, o que torna a aplicação homogênea de pequenas moléculas/tratamentos difíceis16; ou (iv) um reduzido número de plantas9,17. O volume dos tanques hidropônicos descrito em muitos desses protocolos são geralmente grandes (pequenos volumes que variam de 1 a 5 L, até 32 L)18, que faz a aplicação de produtos químicos extremamente caro. Embora alguns estudos descrevem um cultivo hidropônico sob condições assépticas8,19, a montagem do sistema é geralmente bastante trabalhoso, consistindo o ajuste perfeito de malhas de nylon em plástico ou vidro recipientes de5,8,17,20.
Devido à importância de Arabidopsis thaliana como uma planta modelo, a maioria dos sistemas de hidroponia foram projetada para esta espécie1,2,8,14,18, 19 , 20. no entanto, existem poucos estudos relatando as características de crescimento hidropônico de outras espécies de plantas com um pré-tratamento de sementes para melhorar sua germinação e taxas de sincronização em vitro8,16 . Para trabalhar em grande escala, desenvolvemos um protocolo para a criação de um sistema hidropónico manutenção simples e de baixo custo que permite condições estéreis para o cultivo de plantas, incluindo a. thaliana e outras espécies, como a grama Setaria viridis. O método descrito aqui é apropriado para experiências diferentes, como o crescimento do seedling pode ser maximizado, sincronizado e facilmente controlado. Além disso, este sistema tem muitas vantagens como: (i) a sua montagem é simples e seus componentes podem ser reutilizados; (ii) permite a fácil aplicação de produtos químicos diferentes para o meio líquido; (iii) as mudas germinam e crescem diretamente no meio de cultura sem a necessidade de transferência para o sistema de hidroponia; (iv) o desenvolvimento/crescimento atirar e raiz pode ser estreitamente vigiado e as mudas são colhidas sem danos; e (v) torna possível trabalhar em grande escala, mantendo condições fisiológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Essa estrutura hidropônica otimizada permite a cultura de sucesso em vitro de plantas. As sementes germinam bem sobre o meio sólido na superfície plana de ponta de pipeta, um ganho considerável em comparação com sistemas onde as sementes estão encharcadas com a solução nutriente. Uma grande vantagem deste sistema é que durante o desenvolvimento das mudas, raízes diretamente em contato com o meio líquido sem a necessidade de transferência. Além disso, tratamento químico pode ser facilmente aplicado…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação de pesquisa de São Paulo (FAPESP; Conceder 12/19561-0) e a sociedade Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 10407-14/3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), e Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) é grato para as bolsas. Os autores agradecer Christian Meyer do Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, França) generosamente fornecendo anticorpos contra RPS6. Os autores agradecer RTV UNICAMP e Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza, pelo apoio técnico durante o áudio de gravação.
Materials
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
Riferimenti
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
- Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
- Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
- Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
- Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
- Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
- Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
- Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O., Asao, T. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. , 135-152 (2012).
- Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
- Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
- Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
- Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
- Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
- Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
- Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
- Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
- Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
- Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
- Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
- Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
- Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W., Fleischer, S., Fleischer, B. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. 174, 518-552 (1989).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR?. Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
- Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
- Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
- Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
- Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
- Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
- Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
- Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
- Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
- Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
- Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
- Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
- Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
- Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
- Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
- Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
- Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
- Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
- Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
