Summary
ويصف هذا البروتوكول كيفية إعداد اليرقات المورفولوجية لتحليل GC-MS-تعتمد metabolomic.
Abstract
وقد أنشأت التطورات الأخيرة في هذا مجال جميع ذبابة الفاكهة melanogaster المورفولوجية كنموذج وراثية قوية لدراسة الأيض الحيواني. عن طريق الجمع بين مجموعة واسعة من أدوات المورفولوجية الوراثية مع القدرة على مسح مساحات كبيرة من الأيض الوسيطة، يمكن أن تكشف عن نهج جميع التفاعلات المعقدة بين النظام الغذائي والوراثي وتاريخ حياة الأحداث ومنبهات بيئية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اكتشاف الآليات الانزيمية رواية جميع الدراسات وكشف اتصالات مجهولة بين المسارات الأيضية التي تبدو متباينة. من أجل تيسير توسيع نطاق استخدام هذه التكنولوجيا مجتمع المورفولوجية ، هنا نقدم بروتوكول تفصيلية التي توضح هذه المقالة كيفية إعداد عينات اليرقات المورفولوجية للفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)- على أساس تحليل metabolomic. لدينا بروتوكول يتضمن وصفاً لجمع العينات اليرقات واستخراج المستقلب، derivatization الكيميائية وتحليل GC-MS. النجاح في إنجاز هذا البروتوكول سوف تسمح للمستخدمين لقياس الوفرة النسبية لنواتج الأيض القطبية الصغيرة، بما في ذلك الأحماض الأمينية والسكريات والأحماض العضوية تشارك في دورات TCA وتحلل.
Introduction
ذبابة الفاكهة melanogaster المورفولوجية برز كنظام مثالي لدراسة الآلية الجزيئية التي تنظم الأيض الوسيطة. ليس فقط هي حفظت معظم الأيضية بين البشر و المورفولوجية ، ولكن أجهزة الاستشعار المغذيات الرئيسية ومنظمات النمو، مثل الأنسولين، تور، وحركة، تنشط أيضا في أن يطير1،2. كنتيجة لذلك، يمكن استخدام المورفولوجية لاستكشاف الأساس الأيضي للأمراض البشرية تتراوح بين مرض السكري والسمنة نيوروديجينيريشن والسرطان. وفي هذا الصدد، وضع اليرقات المورفولوجية يوفر الإطار المثالي لدراسة برنامج الاستقلابية المعروفة بتحلل الهوائية، أو تأثير واربورغ. تماما كما استخدم العديد من الأورام تحلل الهوائية لتوليد طاقة الكتلة الأحيائية من الكربوهيدرات، حتى للقيام المورفولوجية اليرقات تنشيط تحلل الهوائية لتعزيز النمو التنموي3،،من45. أوجه التشابه هذه بين اليرقات والتمثيل الغذائي الورم تنشئ المورفولوجية كنموذج رئيسي لفهم كيف الهوائية تحلل التنظيم في فيفو.
وعلى الرغم من حقيقة أن الطاير قد برز كنموذج شعبية لدراسة الأيض، تعتمد معظم الدراسات المورفولوجية على الأساليب التي تم تصميمها لقياس نواتج الأيض الفردية3، مثل تريهالوسي أو الشحوم ATP. منذ بروتوكول معين مطلوب لقياس كل المستقلب، الدراسات على أساس مقايسة كثيفة العمالة ومكلفة، ومنحازة إلى تلك المركبات التي يمكن أن تقاس باستخدام مجموعات تجارية. التوصل إلى حل لهذه القيود برز من الحقل لجميع، الذي يوفر وسيلة أكثر كفاءة وغير متحيزة لدراسة الأيض المورفولوجية . خلافا لدراسة على أساس المقايسة، يمكن إجراء تحليل metabolomic واحد في نفس الوقت قياس المئات من جزيء صغير من الأيض وتوفير فهم شامل للكائن الحي حالة ايضية6،7. هذا الأسلوب اتسع إلى حد كبير نطاق الدراسات المورفولوجية الأيضية ويمثل مستقبل هذا المجال الناشئ8.
وتجري دراسات Metabolomic أساسا باستخدام ثلاث تقنيات: (ط) الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) و (ثانيا) السائل اللوني-الكتلي (LC-MS) (ثالثا) الفصل اللوني للغاز-قياس الطيف الكتلي (GC-MS)9. يقدم كل نهج متميز من مزايا وعيوب، وكل من هذه التقنيات قد استخدمت بنجاح دراسة الأيض المورفولوجية . نظراً للبحث الذي أجرى في المختبر لدينا يركز على نواتج الأيض الصغيرة، والقطبية، نحن نوظف أسلوب GC-MS-تعتمد أساسا. GC-MS ويوفر للمستخدم مع عدد من المزايا، بما في ذلك إمكانية تكرار نتائج عالية، القرار الذروة، والحساسية، وتوفر مكتبة الطيفية الأثر (الصناعات الاستخراجية) إلكترون القياسية التي تسمح التعرف السريع على اكتشاف الأيضية ميزات10،11. ومع ذلك، إعداد العينات ل GC-MS، معقد نوعا ما ويتطلب عناية بالتفاصيل. يجب جمع العينات وغسلها ووزنه والمجمدة بطريقة يروي بسرعة التفاعلات الأيضية. وعلاوة على ذلك، الذبيحة يطير مقاوم للبروتوكولات القياسية التجانس ويتطلب طاحونة حبة لضمان استخراج المستقلب الأمثل. وأخيراً، يجب أن تخضع العينات التي تم تحليلها بواسطة GC-MS derivatization الكيميائية قبل الكشف عن12. بينما تصف الأساليب المنشورة سابقا كل هذه الخطوات3،،من1314، يزال يلزم بروتوكول بصرية التي تسمح للمستخدم المبتدئ بتكاثر توليد بيانات عالية الجودة. هنا نظهر كيفية تحضير عينات اليرقات المورفولوجية لتحليل جميع GC-MS-تعتمد. يسمح هذا البروتوكول المستخدم لقياس العديد من نواتج الأيض القطبية الصغيرة التي تؤلف استقلاب الكربون وسط تكاثر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع البيض
- جمع البالغين من الذكور والإناث العذراء من الأنماط الجينية المنشودة. على حدة في سن هذه الحيوانات في قنينة غذاء مع وسائل الإعلام بلومينغتون القياسية لمدة 3 – 5 أيام.
- إعداد ماتينجس المناسبة عن طريق نقل 50 العذراء الإناث والذكور 25 إلى قنينة أغذية جديدة.
ملاحظة: ينبغي إعداد الحد أدنى من ستة ماتينجس مستقلة لكل الوراثي. وسيتم جمع عينة واحدة فقط من كل التزاوج (أي ست عينات جمعت من ست ماتينجس المستقلة). -
إعداد قبعات وضع البيض دبس السكر.
- مزيج من 115 مل من دبس السكر وز 29 من أجار مع 700 مل ح2س في قارورة 2 ل.
- يغلي دبس السكر الخليط أجار على طبق ساخن.
- كول إلى 70 درجة مئوية.
- إضافة 25 مل مزيج حمض (20 مل من حامض الفوسفوريك 85% وحمض البروبيونيك مل 209 في 1 لتر من ح2س؛ مخزن في زجاجة براون) و 10 مل إستر الميثيل حمض فهيدروكسي والبنزويك 10% في الإيثانول 95%.
- صب أجار دبس السكر في كل من الغطاء وأسفل جزء من طبق استنبات الأنسجة2 35 × 10 مم.
ملاحظة: قبل سكب الدبس لوحات أجار، تأكد من أن الجفن و/أو قاعدة لصفيحة2 35 × 10 مم تناسب سنججلي في فم زجاجة الأسهم المورفولوجية (كما هو موضح في الخطوة 1، 6). اعتماداً على العلامة التجارية للوحات المستخدمة، قد لا تكون القاعدة صالحة للاستعمال.
- إلى تنشيط الخميرة الطازجة لصق بإضافة الماء المقطر الخميرة الجافة (5 غ خميرة/7 مل من الماء) حتى الخليط يصبح عجينة التي يمكن أن ينتشر بسهولة على سطح صلب (أي، اتساق زبدة الفول السوداني).
- ينتشر حوالي 1.5 غرام من الخميرة لصق على سطح غطاء وضع البيض دبس السكر.
- كزة أربع فتحات الهواء في طرفي نقيض من البلاستيك 6 أوقية. زجاجة المورفولوجية المخزون باستخدام إبرة ز 22.
- نقل الذباب تفعيل حديثا من القنينة الغذاء في زجاجات الثقافة.
ملاحظة: يمكن نقل الذباب أما عن طريق استخدام CO2 كمخدر مؤقت أو بعقد الجزء العلوي من قنينة في فم الزجاجة وشدة التنصت على الجزء السفلي من الزجاجة ضد benchtop. - بسرعة ضع غطاء وضع بيض دبس السكر مع الخميرة لصق على السطح في فم زجاجة الأسهم المورفولوجية . استخدام الشريط مختبر لتأمين غطاء وضع البيض في المكان.
ملاحظة: إذا كان الذباب تم تخديره من قبل لنقل، الزجاجة توضع أفقياً على benchtop حتى شُفي جميع الذباب. مرة الذباب على المحمول تماما، ضع الزجاجة في حاضنة مع غطاء وضع البيض دبس السكر في الجزء السفلي من الثقافة. - استبدال الغطاء وضع البيض دبس السكر مرة واحدة على الأقل يوميا لأول يومين بعكس الزجاجة الأسهم والتنصت على الجزء السفلي من الزجاجة ضد benchtop وإزالة الغطاء البيض القديم وفورا وضع قبعة بيضة جديدة في فم الزجاجة. تجاهل الحد الأقصى القديم وضع البيض.
ملاحظة: هذه الخطوة يضمن أن الإناث لا نحتجز بيضها ويسمح لمجموعة من السكان متزامنة. - ضع غطاء جديد وضع البيض في زجاجة الأسهم بعد يوم 3، استبدال بعد ح 2، وتجاهل. إزالة واستبدال الغطاء وضع البيض الثاني بعد أربع ساعات. التسمية أسفل هذا الغطاء وضع البيض مع التاريخ والوقت، والتركيب الوراثي.
ملاحظة: سيتم استخدام البيض التي تم جمعها خلال هذا الإطار 4 ح للتحليل. تعد هذه الخطوة تزامن الحرجة لتحليل مراحل تنموية محددة. ويمكن جمع البيض بهذه الطريقة لعدة أيام. - إدراج قبعات وضع البيض إلى 60 × 15 ملم2 طبق بتري والمكان إلى حاضنة في المرغوب فيه درجة الحرارة والرطوبة.
- فحص قبعات وضع البيض كل يوم لمشاكل المجاعة، والكثافة السكانية أو التلوث.
ملاحظة: يجب أن يكون لديك اليرقات الوصول إلى الغذاء الكافي لضمان التطوير المستمر. إذا لزم الأمر، يمكن أن تنتشر لصق الخميرة الطازجة في كل الحروف كبيرة وضع البيض التي سيتم استخدامها في التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كانت الكثافة السكانية اليرقات عالية جداً، سوف تبدأ اليرقات التجول خارج لوحة الثقافة. وينبغي أن لا تستخدم هذه العينات للتحليل metabolomic نظراً للكثافة السكانية العالية والمتوسطة نوبات من المجاعة بينما تجول من ذوي الخبرة سيؤدي إلى عدم اتساق البيانات. الأوسط كثافة ~ 80 – 100 الثانية الطور اليرقات (L2) للوحة الواحدة أو 40 – 50 يوصي بيرقات الطور الأوسط الثالثة (L3) للوحة الواحدة. يجب أن يتم تجاهل العينات بشكل واضح ملوثة بالبكتيريا أو الفطريات.
2-جمع العينات اليرقات
- عمر اليرقات حتى المرحلة المرجوة. إذا كان جمع اليرقات L3، مزامنة عينات في تساقط L2 – L3. ويتحقق إعادة المزامنة عادة باستخدام أسلوب هو موضح سابقا يستخدم spiracles الأمامي كالمعالم التنموية15. بدلاً من ذلك، يمكن أن تكون متزامنة منتصف L3 اليرقات باستخدام جينات مراسل sgs3 16.
ملاحظة: في هذا الصدد، نجد منتصف L2 (ح ~ 60 بعد وضع البيض) يرقات مثاليا لمعظم التحليلات لأن اليرقات التنمية لا يزال متزامن نسبيا في هذه المرحلة، والعينات التي تم جمعها بعناية بالغذاء الكافي لتطوير لهذا تيميبوينت، عدد الحيوانات كل عينة يمكن التحكم فيها (انظر أدناه). خطوة إضافية تزامن ضروري لليرقات L3 لأن البقول ecdysone العديدة التي تحدث أثناء تطوير L3 آثاراً مأساوية على الأيض وسيولد التحف في السكان غير المتزامنة. - استخدام إبرة تشريح لرفع لصق الخميرة قبالة أجار لطف. وضع الخميرة على سقف أجار دبس جديدة.
ملاحظة: سوف أكل معظم اليرقات في الواجهة بين أجار دبس السكر وعجينة الخميرة. - استخدام الرسام صغيرة جمع اليرقات من سطح مكشوف حديثا من أجار دبس السكر. وضع اليرقات في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل على الجليد.
ملاحظة: حجم العينة المناسبة لكل مرحلة من مراحل النمو كما يلي: 50 إينستار الأولى يرقات (L1)؛ 25 منتصف L2 اليرقات؛ 20 يرقات L3 المبكر؛ 15 منتصف L3 أو أواخر L3 اليرقات. - أغسل وتجميد عينات (خطوات 2.3 عن طريق 2.8) على دفعات صغيرة (أربع إلى ست عينات) حين جمع مجموعة عينة كبيرة. يجب تجميد عينات خلال 20 دقيقة من وضع اليرقات في أنابيب.
ملاحظة: أننا نوصي باستخدام ايبندورف 1.5 مل "فليكس أنابيب" لأنابيب أخرى قد تتداخل مع نقل عينة في الخطوة 3. يجب جمع العينات في أنابيب [ميكروفوج]. لا تقوم بجمع العينات في أنابيب حبة الموضحة في الخطوة 3، 1. الاحتفاظ بحبات السيراميك الحل أغسل كلوريد الصوديوم، الذي ينتج عن القياسات الشامل غير دقيقة ويدخل الملوثات في العينة. - أضف 1 مل من المثلج 0.9% كلوريد الصوديوم في الأنبوب، إغلاق الغطاء، ورأسيا الوجه أنبوب لدقة لغسل اليرقات.
- ضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد ل ~ 30 ثانية. خلال هذا الوقت، اليرقات سوف تنزل إلى الجزء السفلي من الأنبوب، ولكن تبقى الخميرة في تعليق. مرة واحدة وشكلت يرقات جميع بيليه فضفاضة، إزالة الحل كلوريد الصوديوم باستخدام ماصة 1 مل.
- كرر الخطوتين 2.4 و 2.5 ضعف، أو حتى يتم الحل النهائي يغسل واضحة.
ملاحظة: قد يكون خطوات الغسيل الإضافية اللازمة إذا كانت العينة التي تم جمعها تحتوي على كمية زائدة من الخميرة. - الطرد المركزي في عينات 2,000 × ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة جميع الحل المتبقية باستخدام ماصة 200 ميليلتر.
- فورا تجميد العينة في نيتروجين سائل.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً في البروتوكول في هذه الخطوة. ويمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى 3 أشهر في-80 درجة مئوية.
3. نقل العينات إلى أنابيب حبة
- يجب نقل كل عينة اليرقات من 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب لأنابيب screwcap 2 مل التي تحتوي على حبات السيراميك 1.4 ملم. في التحضير لهذه الخطوة نقل، استخدم علامة واقية من الإيثانول للتسمية على الجانب من أنبوب حبة screwcap 2 مل (سيتم تدمير علامات على الغطاء أثناء الخطوة 4، 4).
- تغليف كتلة الأنبوبة المسماة حبة استخدام رصيد تحليلية قادرة على قياس دقة 0.01 ملغ.
- إذا تم تخزين عينات اليرقات في-80 درجة مئوية، وضع أنابيب العينة في النتروجين السائل قبل نقلها.
- استخدام الملقط طويلة لإزالة أنبوب عينة 1.5 مل من سائل النيتروجين ديوار.
- الاستيلاء على ارتداء القفازات النتريل، المجمدة في أنبوب وعكس انخفاضا حادا الجنيه غطاء أنبوب ضد benchtop إلى إزاحة بيليه المجمدة. فورا صب بيليه في أنبوب حبة screwcap تريد قبل 2 مل. في حال عدم إزاحة بيليه، العودة الأنبوب للنتروجين السائل وتكرار.
ملاحظة: سوف لا إزاحة الكريات اليرقات من جميع [ميكروفوج] أنابيب. إذا كان استخدام أنبوب خلاف الموصى بها، تحديد إذا كان يمكن فكها الكريات اليرقات قبل جمع عينات للتحليل. - قياس الكتلة مجتمعة من الأنبوب بيليه وحبه اليرقات بسرعة. فورا بوضع أنبوب عينة في النيتروجين السائل. بيليه اليرقات وستستخدم وسائل تطبيع البيانات metabolomic.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً في البروتوكول في هذه الخطوة. ويمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى 3 أشهر في-80 درجة مئوية.
4-نموذج استخراج
- وضع أنابيب العينة في benchtop-20 درجة مئوية برودة.
- إضافة 0.8 مل ميثانول 90% بريشيليد (-20 درجة مئوية) التي تحتوي على حمض سوكسينيك-d4 ميكروغرام/مل 2 في كل أنبوب. إرجاع العينة إلى benchtop-20 درجة مئوية أكثر برودة.
ملاحظة: حمض سوكسينيك-d4 بمثابة معيار داخلي. استخدم فقط [هبلك] الصف ح2س والميثانول. منذ الميثانول والمذيبات العضوية الأخرى متقلبة ويصعب قياس دقة استخدام الهواء التشريد الممصات، نوصي باستخدام الماصات التشريد إيجابية لهذه الخطوة وكل الخطوات التالية. - قم بإعداد عنصر تحكم سلبية عن طريق إضافة 0.8 مل ميثانول 90% بريشيليد (-20 درجة مئوية) يحتوي على حمض سوكسينيك-d4 ميكروغرام/مل 2 في أنبوب حبة فارغة.
- مجانسة عينات ل 30 ثانية الساعة 6.45 m/s باستخدام الخالطون طاحونة حبة الموجود في غرفة مراقبة درجة حرارة 4 درجات مئوية.
ملاحظة: عدم تجانسه سريعاً وتماماً بيليه اليرقات مصدر مشترك لتقلب في تحليل جميع. فقط استخدام أجهزة المجانسة التي قادرة على تدمير تجميد الأنسجة اليرقات خلال 30 ثانية. - العودة أنابيب العينات المتجانس ل benchtop-20 درجة مئوية أكثر برودة واحتضانها لهم في ثلاجة-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
- الطرد المركزي أنابيب 20,000 × ز أو أقصى سرعة لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية لإزالة ترسبات الناتجة عن ذلك.
- نقل 600 ميليلتر من المادة طافية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة. عدم الإزعاج ترسبات. إذا يصبح فكها بيليه المتعجلة بينما بيبيتينج المادة طافية، عودة جميع المادة طافية إلى الأنبوب وكرر الخطوة 4، 6.
- وضع أنابيب العينة في فراغ للطرد مركزي. تأكد من أن جميع الأنابيب مفتوحة قبل الختم الطرد المركزي. الجاف للعينات في درجة حرارة الغرفة حتى تتم إزالة جميع المذيبات (هذه الخطوة عادة ما يستغرق ح ~ 16 الكامل).
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن يكون مؤقتاً في البروتوكول في هذه الخطوة. ويمكن تخزين العينة المجففة في-80 درجة مئوية.
5-المواد الكيميائية Derivatization
- إذا تم تخزين العينات المجففة في-80 درجة مئوية، وضع أنابيب عينة غير مفتوحة في فراغ للطرد مركزي والجاف لمدة 30 دقيقة. يجب أن تتم هذه الخطوة قبل افتتاح أنبوب عينة.
ملاحظة: هذه الخطوة إزالة التكثيف الذي يجمع في الخارج من [ميكروفوج] أنابيب عند إزالة من الثلاجة. هذا الجزء من البروتوكول حساسة للغاية ح2س، ويجب اتخاذ الاحتياطات الإضافية لإبقاء جميع الكواشف جافة قدر الإمكان. -
تعد حلاً 40 مغ/مل ميثوكسيلاميني هيدروكلوريد (MOX) في بيريدين اللامائى. استخدم فقط بيريدين اللامائى. تخزين موكس وبيريدين في مجفف وإعداد الحل موكس يوميا.
تنبيه: موكس وبيريدين مواد سامة. إعداد هذا الحل في غطاء الدخان.- استخدام بندقية حرارة الجافة حقنه زجاجية 1 مل.
- أدخل إبرة المحاقن في زجاجة بيريدين اللامائى. إزالة 1 مل بيريدين وإضافة إلى أنبوب [ميكروفوج] الذي يحتوي على 40 مغ من الأكسيد المختلط.
- مسح زجاجة بيريدين اللامائى مع الأرجون. ختم الزجاجة والعودة إلى مجففة.
- حل موكس في بيريدين واسطة تفرخ الأنبوب في خلاط حراري عند 35 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في 600 لفة في الدقيقة.
- إضافة ميليلتر 40 40 مغ/مل موكس في حل بيريدين اللامائى للعينة المجففة.
- دوامة 10 s وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز (10,000 x ز ل 20 ثانية).
- احتضان عند 30 درجة مئوية ح 1 600 لفة في الدقيقة في خلاط حراري.
- الطرد المركزي في 20,000 × ز أو السرعة القصوى لمدة 5 دقائق لإزالة الجسيمات هذه المسألة.
- نقل 25 ميليلتر من المادة طافية في قنينة أوتوسامبلير مع إدراج ميكروفولومي زجاج 250 ميليلتر المعطلة.
- إضافة 40 ميليلتر من N-ميثيل-N-تريميثيلسيليلتريفلوراسيتاميدي (مصطفى) الذي يحتوي على 1% فصليا.
تنبيه: مصطفى السامة. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان.
ملاحظة: إذا كان متوفراً، يمكن إكمال هذه الخطوة قبل أوتوسامبلير جيرستيل. - ضع غطاء على القنينة أوتوسامبلير وختم باستخدام أداة المكشكش.
- احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة مع الرج (250 لفة في الدقيقة).
- إعداد الأحماض الدهنية الميثيل إستر قياسي (الشهرهشهره) حل كما سبق ديسسيريبيد3. إضافة 3 ميليلتر من الشهرهشهره إلى القنينة أوتوسامبلير استخدام أوتوسامبلير روبوتية قبل الحقن مباشرة.
ملاحظة: تستخدم الشهرهشهره لمعايرة التحول الوقت الاستبقاء والتحقق من أداء الصك. إذا لم أوتوسامبلير إليه (روبوت) متوفراً، يمكن إضافة الشهرهشهره أثناء الخطوة 5.8.
6-اكتشاف GC-MS
ملاحظة: في معظم الحالات، المستخدم سيتم إجراء هذه الخطوة بمساعدة مرفق الأساسية الطيفي الشامل. تم تصميم هذا البروتوكول ليتم استخدامها مع 30 مترا، العمود GC مع عمود حرس 5 أمتار.
- الأمر عينة بطريقة عشوائية.
-
إعداد GC-MS.
- تعيين معدل تدفق غاز الهليوم الناقل إلى 1 مل/دقيقة.
- ضبط درجة حرارة مدخل إلى 250 درجة مئوية.
- برنامج GC لتنفيذ التدرج درجات الحرارة التالية:
- درجة الحرارة الأولية إلى 95 درجة مئوية مع عقد من 1 دقيقة.
- زيادة درجة الحرارة إلى 110 درجة مئوية بمعدل 40 درجة مئوية/دقيقة مع عقد من 2 دقيقة.
- زيادة إلى 250 درجة مئوية بالمنحدر 5 درجة مئوية/دقيقة.
- زيادة إلى 330 درجة مئوية بمعدل 25 درجة مئوية/دقيقة مع عقد نهائي من 4 دقيقة.
- تعيين تأخير المذيبات إلى 3.5 دقيقة.
ملاحظة: يمكن تغيير الوقت حسب النظام GC-MS. والغرض من هذه الخطوة منع مستفا والاكسيد المختلط من إتلاف الجهاز.
- حقن 1 ميليلتر من العينة ديريفاتيزيد GC-MS (تقسيم نسبة 10:1).
ملاحظة: حقن 2 ميليلتر من عينة إذا كانت كثافة قمم منخفضة جداً. ينبغي أن تكون التجارب المعشاه ذات ترتيب حقن عينات. - تعمل مطياف الشامل في وضع المسح الضوئي الكامل على نطاق شامل من 50 – 500 م/z.
7-بيانات التحليل
- تحليل بيانات metabolomic باستخدام أما نهج المستهدفة أو غير المستهدفة. تحليل هادفة تركز على قياس الوفرة من مجموعة محددة من نواتج الأيض، مثل القياسات لاكتات نحن تصف أدناه. على النقيض من ذلك، يستخدم تحليل تشتته نهجاً غير متحيزة لتحديد أي ميزة الأيضي أن يتغير إلى حد كبير بين مجموعتين من مجموعات العينة.
ملاحظة: لدينا مختبر أساسا يستخدم برامج مجانية ميتاليجن17 و18،ميتابواناليست19 لتحليل البيانات. وبوصف كافية لمراقبة الجودة، والتطبيع، وخطوات تجهيز البيانات خارج نطاق هذه المخطوطة، نشير المستخدم إلى بروتوكولات أكثر تفصيلاً أن تكون مكرسة لمعالجة البيانات20،21، 22. وباﻹضافة إلى ذلك، مخطط تدفق تصف الخطوات المطلوبة لهذا التحليل ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لاكتات نازعة المسوخ (دلده)، والتي تفتقر إلى النشاط دلده4، وعناصر مطابقة وراثيا وجمعت يرقات منتصف L2 وتجهيزها وفقا للبروتوكول المذكورة أعلاه. عند مقارنة مع عناصر التحكم، اليرقات متحولة يحمل تغييرات كبيرة في لاكتات، بيروفات ول-2-هيدروكسيجلوتاراتي4. تم اقتناء الأطياف مع نظام اجيلنت GC6890-5973i مرض التصلب العصبي المتعدد. مثال من أطياف GC-MS تولد مع لدينا بروتوكول ويرد في الشكل 1. وهناك العديد من الميزات المرئية وذروة ملحوظة تريهالوسي، الذي يمثل ذروة أكبر في عينة يرقات عادة وهي عادة oversaturated (الشكل 1 أ، ب). طيف الفردية من عينة مراقبة سلبية يرد في الشكل 1. على الرغم من أن لا تزال هناك عدة قمم مرئية في العينة المراقبة السلبية، يتم تقليل الكثافة وعدد القمم عند مقارنة مع العينات التجريبية هو مبين في الشكل 1 أ، ب. هذه القمم ينتج أساسا من التسييل العمود والمعايير الداخلية (حمض سوكسينيك-d4)، الشهرهشهره، والأحماض الدهنية تلويث. إعداد عينة الفاشلة سوف تولد طائفة مشابهة لتلك المبينة في الشكل 1.
كل الأطياف كانت preprocessed باستخدام ميتاليجن17 وتم تطبيع البيانات مع المعايير الداخلية وبيليه الشامل. وفي وقت لاحق، قدمت البيانات إلى18،ميتابواناليست19 للتحليل الإحصائي. تحليل مكون مبدأ (PCA) يبين بوضوح أن هاتين المجموعتين منفصلة عن بعضها البعض، وأن ليس هناك أي الخارجة في المجموعة أما (الشكل 2A). مزيد من التحليل يظهر تغييرات كبيرة في نواتج الأيض المعروف أن تتأثر بفقدان دلده (الشكل 2)4.
الشكل 1 : الممثل GC-MS أطياف المورفولوجية استخراج اليرقات. (أ-ب) نموذجية من الأطياف منتصف L2 اليرقات مقتطفات من نوع البرية (WT) وطفرات دلده (كو). (ج) ممثل GC-MS طائفة المتولدة من عينة مراقبة سلبية (NC). معظم القمم في هذه الطائفة من المعايير الداخلية، الشهرهشهره، والأحماض الدهنية. (د-و) بالمقارنة مع عينات WT، المعرض عينات كو رفع مستويات بيروفات (د) وانخفاض مستويات اللاكتات (ه) و (و) 2-هيدروكسيجلوتاراتي (2-HG). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحليل إحصائي يوضح ملامح ايضية مختلفة بين نوع البرية (WT) ودلده خروج المغلوب (كو) اليرقات. (أ) الأرض عشرات محكمة التحكيم الدائمة. (ب) نواتج الأيض الذي يحمل تغييرات كبيرة في طفرات دلده . يتم رسم كافة نقاط البيانات بالنسبة لمتوسط وزن عنصر التحكم، والتي تم تعديلها إلى قيمة عشوائية مكونة من 100. قبل التحليل، تم تطبيع البيانات لحمض سوكسينيك-d4 الداخلية القياسية واليرقات بيليه الجماهيري. البيانات كما هو موضح يعني ± انحراف معياري واحد. ف < 0.01 لجميع نواتج الأيض استخدام ثنائي الطرف تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جميع يوفر فرصة لا مثيل لها لدراسة التفاعلات الأيضية التي تؤلف أيض وسيطة. الحساسية لهذه التكنولوجيا، ومع ذلك، يجعل البيانات عرضه للخلفية الوراثية والعظة التنموية، ومجموعة متنوعة من الضغوط البيئية، بما في ذلك درجة الحرارة، والرطوبة، والكثافة السكانية، وتوافر المغذيات. ولذلك، عالية يتطلب تحليل جميع الجودة واستنساخه بجمع العينات تحت ظروف خاضعة للرقابة عاليا. بينما تؤكد عدة ملاحظات على هذه النقطة3،،من823، هنا نقدم أسلوب خطوة بخطوة لجمع اليرقات التي تم تصميمها لضمان إمكانية تكرار نتائج.
المصدر الأكثر شيوعاً لتقلب في تحليل جميع ينبع من فشل في إخماد، أو وقف، التفاعلات الأيضية بعد أن يتم جمع العينة. وفي هذا الصدد، سوف تتوقف عملية التمثيل الغذائي عند التجميد في النيتروجين السائل وسيتم تدمير الإنزيمات الاستقلابية عند هو تجانس العينة في الميثانول-20 درجة مئوية. على افتراض أن المستخدم اهتماما خاصا للحفاظ على عينة مجمدة قبل استخراج الميثانول، لدينا بروتوكول يهدف إلى التأكد من أن جميع البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الإجراء تمثل صورة دقيقة الأيض اليرقات. ينبغي تجربة المستخدم مستويات غير مقبولة من تقلب البيانات، المستخدم ينبغي أن تعيد النظر في بروتوكول استخراج جمع والمستقلب مع إيلاء اهتمام خاص لضمان التمثيل الغذائي (1) هذا هو سرعة مروي (خطوات 2.9 – 4.2) و (2) أن كفاءة هو تجانس العينة في 90% ميثانول (الخطوة 4، 4). وفي هذا الصدد، العديد من حبة مطاحن توفير قوة غير كافية مجانسة العينات ضمن الوقت المحدد ونحن نشجع المستخدم باستخدام أداة تم استخدامها في الدراسات السابقة8.
كما يبرز لدينا بروتوكول الخطوات الرئيسية التي يجب ملاحظة المستخدم المبتدئ لتكاثر ديريفاتيزي العينات. وهذا ضروري ل GC-MS لأن العديد من نواتج الأيض المحدودة تقلب أو الثبات الحراري الفقراء. Derivatization يزيد كل من التقلب والثبات الحراري للعديد من نواتج الأيض، وبالتالي زيادة عدد المركبات التي يمكن أن يقاس تكاثر. كنتيجة لذلك، سوف يحمل العينات التي خضعت derivatization ناقصة أشكال ومرتفعات ومناطق الذروة غير قابل لإعادة الإنتاج. كما أننا نؤكد هنا، هي مصدر مشترك derivatization الفاشلة تعرض العينة للماء، مما يقلل من كفاءة derivatization الكيميائية. ولذلك، يجب أن تظل جميع المواد الكاشفة، بما في ذلك مصطفى، والأكاسيد، وبيريدين، تحت ظروف خالية من الرطوبة. الحاجة إلى المحافظة على الظروف الجافة تمتد أيضا إلى إعداد العينات التي يتم تخزينها في-80 درجة مئوية، وينبغي أن توضع في أجهزة الطرد مركزي فراغ لمدة 30 دقيقة قبل فتح لكفالة عدم دخول التكثيف العينة. ونود أيضا أن نؤكد أن GC-MS تكنولوجيا حساسة، ونتيجة لذلك عينات أكبر لن تنشئ بالضرورة بيانات أفضل. لدينا بروتوكول يوفر أحجام العينات المختبرة تجريبيا وسيقيس تكاثر معظم نواتج الأيض في استقلاب الكربون المركزية. بعض من هذه المستقلبات وفيرة جداً وحجم العينة زيادة سيؤدي إلى إشارة التشبع في الطيف. وفي الواقع، الإشارة للفعل مشبعة تريهالوسي في تحليلنا ونسبة تقسيم رفعا لحقن GC-MS يجب أن تستخدم بدقة قياس هذا المركب. وأخيراً، ينبغي ملاحظة المستخدم أن لدينا بروتوكول غير مناسب لاستخراج المادة الدهنية لأننا نستخدم حلاً استخراج قطبية،. كما لا تراعي لدينا بروتوكول الملوثات الأحماض الدهنية التي يمكن أن تكون موجودة في أنابيب بلاستيكية، ونصائح، لماذا تظهر بعض الإشارات الأحماض الدهنية في مراقبة سلبية العينة (الشكل 1B).
وأخيراً، توفر أساليب مفصلة هنا أداة قوية لدراسة الأيض المورفولوجية . بيد أن هذا البروتوكول، هو ليس تحديداً إلى المورفولوجية ، ويمكن استخدامها مع قليل من التعديلات لإجراء دراسات التمثيل الغذائي في أي اللافقاريات الصغيرة. بغض النظر عن الأنواع، يسمح هذا الأسلوب البسيط للتحديد الكمي النسبي لما يقرب من جميع الأحماض الأمينية، وسيطة في تحلل ودورة TCA، فضلا عن عدد من الجزيئات القطبية الصغيرة الأخرى. عندما جنبا إلى جنب مع الأدوات التي لم يسبق لها مثيل الجينية المتاحة للمجتمع المورفولوجية ، يضع هذا النوع من التحليل metabolomic الطاير في طليعة أبحاث التمثيل الغذائي في المستقبل المنظور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وبفضل الأعضاء في مرفق مطيافية الكتلة جامعة إنديانا وجامعة يوتا جميع مرفق الأساسية للمساعدة في الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول. J.M.T. معتمد من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم R35GM119557.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
References
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
- Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
- Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
- Fiehn, O. Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
- Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).
- Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
- Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
- Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
- Garcia, A., Barbas, C. Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).
- Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).
- Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).
- Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
- Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).
