Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ספקטרומטר מסה של ספריי עלה: טכניקה מהירה יינון אמביינט להעריך ישירות מטבוליטים רקמות הצמח

Published: June 21, 2018 doi: 10.3791/57949
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 2
1Department of Horticultural Science, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 2Department of Horticultural Science, Department of Plant and Microbial Biology, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 3Department of Botany and Zoology, Stellenbosch University

Summary

ספקטרומטר מסה של ספריי עלה היא טכניקה ניתוח כימי ישיר זה ממזער את הכנת הדוגמא ומסלקת כרומטוגרפיה, המאפשר איתור מהיר של מולקולות קטנות רקמות הצמח.

Abstract

הצמחים מייצרים אלפי מולקולות קטנות מגוונים תכונותיהם הכימית. ספקטרומטר מסה (MS) היא טכניקה חזקה לניתוח מטבוליטים הצמח מכיוון שהוא מספק מולקולרית משקולות עם רגישות גבוהה. עלה ספריי MS הוא טכניקה יינון הסביבה שבו רקמת הצמח משמש לניתוח כימי ישיר דרך ספקטרומטריית electrospray, סילוק גזים מהתהליך. גישה זו הדגימה מטבוליטים מאפשר מגוון רחב של מחלקות כימי יזוהו בו זמנית של רקמות הצמח ללא פגע, למזער את כמות הכנת הדוגמא הדרושים. בעת שימוש עם MS המוני ברזולוציה גבוהה, מדויקת, עלה ספריי MS מקלה על גילוי מהיר של מטבוליטים של ריבית. זה גם אפשרי לאיסוף נתונים פיצול tandem המוני בטכניקה זו כדי להקל על זיהוי המורכב. השילוב של מדידות מדויקות המוני הפיצול הוא מועיל המאשרת זהויות מורכבים. התרסיס עלה MS הטכניקה דורש רק שינויים מזעריים מקור יינון nanospray, הוא כלי שימושי להרחיב את היכולות של ספקטרומטר מסה. . הנה, רקמות עלים טריים של Sceletium tortuosum (חיעדיים), צמח מרפא מסורתי מדרום אפריקה, ניתוח; אלקלואידים mesembrine רבים מזוהים עם תרסיס עלה MS.

Introduction

צמחים מכילים מגוון רחב של מולקולות קטנות עם מאפיינים כימיים מגוונים. MS היא טכניקה חזקה לניתוח תרכובות צמחים כי זה יכול לספק יצירות היסודות עם רגישות גבוהה, ירידה לפרטים עבור איתור וזיהוי של מטבוליטים1. ולרוב, MS מתבצע על הממס, חילוץ דגימות, אשר מופרדים באמצעות כרומטוגרפיה לפני ניתוח MS1. עם זאת, השימוש של כרומטוגרפיה נוזלית (LC) דורש ניתוח ממושך פעמים, קשורה לעיתים קרובות עם הכנה דגימה נרחבת1. לעומת זאת, ניתוח כימי ישיר של רקמות ללא פגע העוקפות כרומטוגרפיה היא טכניקה מהירה מאוד, הדורשים הכנה מדגם מינימלי2. לפיכך, במקרים שבו יכול להיות forgone צעדים כרומטוגרפי, ניתוח כימי ישיר יכול להיות יתרון מאוד.

LC-MS טיפוסי למחקר גליקומיקס ומוצרים טבעיים מסתמך על עקירות בצובר ממושך של צמחים מיובשים או קפוא בחומרים המכילים מספר רקמות וכן סוגי תא3. לחלופין, אנליזה כימית ישיר, כגון זיהוי MS מטבוליטים מרקמות הצמח, ניתן לבודד את סוגי תאים ולהימנע הכנת חפצים4. תרסיס עלה MS, המכונה גם רקמות-תרסיס5,6, היא טכניקה יינון אמביינט ישירה MS, המחייב בעיקרו של דבר אין מדגם הכנה5,7. ריסוס העלים ש-MS קשורה קשר הדוק נייר ספריי MS, טכניקה יינון אמביינט עם מאפייני יינון ספקטרומטריית electrospray המאפשר איתור analytes אשר מופקדים על גבי נייר7. למרות השם, עלה ספריי MS החלים על סוגים שונים של רקמות הצמח לא רק עלים, כבר הפגינו על פירות, זרעים, שורשים, רקמות פרחים, פקעות, בין היתר6,8,9, 10,11,12. הטכניקה מקלה על יינון של פיטוכימיקלים אנדוגני ישירות מן החומרים צמח לתוך ספקטרומטר מסה זיהוי8. תרסיס עלה MS יכולים גם לספק מידע על חלוקת כימיקלים רקמות שונות סוגי צמחים13מרחבית. כאשר עלה ספריי MS מושווה עם מיצוי הממס, LC-MS, התוצאות להציע ספריי עלה ש-MS מאפשר איתור מטבוליטים משטח מהיר של סוגי תאים ייחודיים כגון trichomes13. איור 1 מדגימה הגדרת ניסיוני של ספריי MS עלה. יינון ישירה ספקטרומטריית electrospray מתרחשת לאחר רק מקור קטין שינויים. מתח גבוה מוחל על רקמת הצמח באמצעות מלחציים מתכת, ייצור תרסיס של droplets טעונה מאוד יוצרים קונוס טיילור שנושאת היונים לים יון של ספקטרומטריית Electrospray גב' יינון מתרחשת הנוזל הטבעית של הצמח או של תפוח הממס מטען לשטח המפעל. קצה מחודד על הרקמה מקלה את ספקטרומטריית electrospray והוא יכול להיות באופן טבעי המתרחשים או שזה נוצר על ידי חיתוך.

תרסיס עלה MS היא שיטה מהירה לניתוח כמותיים למחצה של רקמות צמח שלם אשר נמצאו כלי שירות למגוון רחב של יישומים. לדוגמה, הטכניקה שימש כדי לזהות תרכובות אנדוגני כדי להבחין בין מינים קרובים, וכן אפילו להעריך שינויים מאותו המין גדל בתנאים שונים. מחקרים קודמים הראו גישה זו על ידי מדידת מטבוליטים ב- beautyberry (Callicarpa ל') 12 ו ג'ינסנג אמריקאי (Panax quinquefolium ל') 6. בדוגמה השנייה, ginsenosides, חומצות אמינו, oligosaccharides יכול להתגלות הרטבת ג'ינסנג raw רקמות. ג'ינסנג אמריקאי מעובדים הפראית היו תריז פקעת פרוסות6. ג'ינסנג פקעת שלמות השתמר מצליחה ספריי עלה MS, אשר אפשרה עבור בדיקת מיקרוסקופיים מורפולוגיים6. יתר על כן, תרכובות אקסוגני על דגימות צמח ניתן לזהות גם. מספר של חומרי הדברה (acetamiprid, diphenylamine, imazalil, linuron ו thiabendazole) זוהו על קליפת או ספרות זולה של פירות וירקות9. בעוד מחקרים אלה ועוד רבים אחרים הראו את התועלת של ספריי עלה MS למטרות ספציפיות שונות, פרוטוקול מפורט לא דווחה בעבר.

. הנה, התיאור פרוטוקול לא יתמקד אופטימיזציה של השיטה עבור רקמה ספציפית או מורכבים. במקום זאת, הגילוי של אלקלואידים mesembrine מן N.E.Br Sceletium tortuosum (ל')-(חיעדיים) משמש כדוגמה כדי לדון בצעדים הדרושים אופטימיזציה שיש לנקוט בעת הגדרת ניסוי MS ספריי עלה על זן, רקמות, או compound(s) בפעם הראשונה. ס tortuosum היא מהם ייחודיים עסיסי האזור Karroo צחיח למחצה של דרום אפריקה. הרפואה המסורתית של ה-San חוי חוי העמים, היא שימשה תיאבון, צמא דיכוי גם באשר14,שלה השפעות תרופות פסיכוטרופיות כאבים15. כיום, תמציות מתוקננת משמשים לטיפול מנוטלי והפרעות שתלמידים16,17. תרכובות הראשי עניין כוללים את mesembrine אלקלואיד ונגזרותיו, שרבים מהם נמצאים גם מינים קרובים Sceletium 15. אוכלוסיות פרא והן מעובדות של tortuosum ס יש ריכוזים משתנים של אלקלואידים mesembrine, לכן הצגת האתגר של בקרת איכות18. שיטת איתור מהיר של אלקלואידים mesembrine, כגון תרסיס עלה MS, עשוי להיות שימושי פיקוח על מוצרים Sceletium . כי בעבר, היו לא מפורט חזותי נסיוני התרסיס עלה MS טכניקה, ימחיש לנו השיטה באמצעות הדוגמה של tortuosum סהבא מתואר: השינוי של מקור nanospray, מבחר, הכנה של רקמות הצמח, רכישת הנתונים, את הפרשנות של התוצאות, אופטימיזציה של הפרמטרים MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שינויים למקור Nanospray עבור עלה לרסס MS

  1. להשתמש במקור nanospray ששונה לריסוס עלה MS. ככל לא fluidic רכיבים נחוצים עלה ספריי MS, לשנות את המקור על-ידי הסרת החללית LC מן המקור.
  2. להרכיב את החוט MS ספריי של עלה שיחולו על רקמת הצמח עם ה-pin המתאים עבור חיבור למקור המתח. הלחמה את הסיכה על קצה אחד של כבל מבודד; הלחמה מלחציים לקצה הנגדי של הכבל.
    הערה: המלקחיים (סוג קליפ תנין) או אולי אין שיניים. בשביל לרקמות קטנות, מלחציים ללא שיניים היא עדיפה. ניתן להוסיף זרוע פלקס אופציונלי עם מלחציים למקור nanospray לסייע במיקום רקמת הצמח. שים לב כי פרוטוקול זה מתאר באופן ספציפי כיצד לבצע ריסוס העלים MS-היברידית פאול מלכודת יונים המוני מנתח מערכת MS (ראה את הטבלה של חומרים); עם זאת, מערכות MS אחרות עשויים להשתנות כדי לבצע את הטכניקה6. צימוד עלה ספריי MS עם ניתוח כימי בזמן אמת ספקטרומטר מסה נייד ניתן לבצע באתר ללא צורך להעביר את החומר צמח מעבדה19,20.
  3. הצב של אנטי סטטי. השטיח על הרצפה מתחת המקור כדי להפחית את פריקה חשמל שעלולות להתרחש מן המקור בעת שימוש מתח גבוה.

2. הכנה של מערכת MS עלה ספריי MS

  1. אם המערכת כבר לאחרונה בשימוש, לאפשר קריר למגע ולהסיר כל מקור חלופי והחרוט לטאטא. לצרף את מקור MS nanospray ספריי עלה.
  2. צור קובץ מנגינה עם הפרמטרים המתאימים יינון הגדר כדלקמן: נדן, עזר וגז לטאטא 0; המתח ספריי כדי kV 2-5; הטמפרטורה נימי 150-250 מעלות צלזיוס; ואת רמת S-עדשה RF ל- 50. שמור את הקובץ מנגינה עם8,13הפרמטרים הרצויים. למטב את מתח וטמפרטורה יינון הטוב ביותר של הרקמה, compound(s) עניין.
    הערה: טוב כנקודות התחלה הם 4 kV ו- 200 מעלות צלזיוס.
  3. להפוך קובץ בשיטה כולל את הקובץ המנגינה של ספריי MS עלה עם: MS מלא חיוביים ושליליים; רזולוציה של 70,000; מטרה AGC של עונה 1 פרק 10-6; מספר מרבי של 200 ms; הסריקה הרצויה בטווח מ/z. לחלופין, השתמש רק 1 קוטביות.

3. הכנת כלי נגינה, ממיסים, רקמות הצמח

הערה: תמיד ללבוש כפפות, והם אינם משתמשים רקמת הצמח טופל בידיים חשופות. אחרת, מזהם יונים כגון פוליאתילן גליקול ישלוט הספקטרום.

  1. להביא את רקמות הצמח לניתוח כדי באותו החדר למערכת MS כדי לאפשר דגימה מהיר.
  2. בשביל לרקמות הצמח שאין טיפ טבעי המחודד, השימוש תער על משטח זכוכית לחתוך נקודה מחודדות (איור 2). לקבוע את כמות רקמת לצורך הניתוח מבוסס על נגינה רגישות, סוג הרקמה, compound(s) עניין (למשל, צעירים tortuosum ס העלה את זה ~ 5 מ"מ אורך).
    1. לחתוך tortuosum ס יוצא 10 שבועות לאחר נביטה לרצועות דק, כל אחד עם קצה ישרים כדי ליצור נקודה.
  3. להשתמש מלקחיים לבחירת בעדינות את רקמת הצמח בסופו של דבר זה להיות כשכרטיס. מחזיק את הרקמה עם מלקחיים, בזהירות להעביר אותו המלחציים.
    התראה: אל תיגע המקור כלי אם המתח.
  4. להתאים את היד גמיש ואת החוט עם המלחציים כדי למקם את הרקמה בקו הים MS כך המרחק בין רקמת הצמח לים יון של MS הוא 5-10 מ מ עבור פאול טריפל (למשל, TSQ), ליניארי מלכודת פאול (LTQ) ל- 10 -50 מ מ מלכודת יונים מנתח המוני (למשל, orbitrap)8.
    1. חבר את הקצה השני של החוט לתוך המקור. אם הניסיונות הראשונים לייצר עוצמת אות נמוכה, להעביר את רקמת הצמח קרוב לים יון (ראה הדיון עבור אופטימיזציה).
  5. לטעון את הקובץ שיטה; שם קובץ הנתונים ולהגדיר את מיקום האחסון של קובץ. לאחר מכן להפעיל את מערכת MS על-ידי לחיצה על הפעל , לחץ על התחל כדי להתחיל רכישת נתונים.
  6. להחיל את הממס (למשל, מתנול) באמצעות pipet עם טיפ העמסה ג'ל כדי להגדיל את המרחק בין הידיים של מתח גבוה כדי להגן על המשתמש.
    הערה: אמצעי האחסון הממס הנדרש תלוי בגודל, יובש, ואת המרקם של הרקמה, בדרך כלל ~ 2-20 µL. ס tortuosum עלים אינם דורשים כל הממס שיתווספו. בזהירות החל הממס, אל תיגע המקור כלי כאשר מופעל המתח. השתמש LC-MS כיתה ממיסים וכלי זכוכית כי כבר חומצה שטף ו ללא חומרי ניקוי. ברקמות מסוימות, אות ייבחנו ללא התוספת של הממס בשל התכנים מים טבעיים של רקמת הצמח. עם זאת, עוצמת אות רבתי עם S/N מופחתת מושגת בדרך כלל על-ידי החלת הממס של הרקמה.
  7. לרכוש את הנתונים כל עוד האות נמשכת או עד שנאסף ספקטרום נאותה, בדרך כלל 30-60 s. אם יש צורך, החל הממס נוספים לשמור על עוצמת שידור גבוהה עבור כמות זמן רב יותר של זמן. עוצרים את חדרי קירור והקפאה, להשהות את מערכת MS.
  8. להסיר את הרקמה ולשטוף את המלחציים עם 100% מתנול, מחיקה נטולת מוך. לנקות את כניסת יון MS לאחר כ 1-2 h של רכישת על ידי ריסוס העלים MS בהתאם למפרטים של הספק. גם, לנקות את כניסת יון MS בין ניתוחים של סוגי רקמות שונות.

4. הנתונים לטיב הערכה

  1. פתח את קובץ הנתונים ולבדוק ויזואלית chronogram המונים את שיא הבסיס. בדוק עוצמת האות ~1.0 x 107 ל 5.0 x 108. אם האות הוא נמוך, להעביר את הרקמה קרוב לים יון. אם יותר גבוה, החזית של מערכת MS יהיה מלוכלך, אז להעביר הרקמה רחוק יותר לים יון.
  2. בהתבסס על נוכחות או היעדרות של היונים עניין ב ספקטרום המוני המיוצר, לשנות את הפרמטרים.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

5. טנדם פיצול המונית

  1. להחליט מה יונים הן עניין עבור פיצול המוני טנדם (MS/MS); אות ספקטרה המונית זה > 1.0 x 105 היא מספקת המבחר של יונים עבור MS/MS.
  2. להפוך קובץ שיטה חדשה עם רשימת הכלילה של m/z החוצה 4 ספרות אחרי הנקודה העשרונית. לחץ על רשימות הכללית והכללה. תחת מאפייני פ. ר, בחר את האנרגיה פיצול [למשל, אנרגיית התנגשות מנורמל (פליטות) של 30-50 הוא מגוון להתחיל עם] ופרמטרים אחרים MS/MS.
    1. כדי לקבל נתונים MS/MS אלקלואידים mesembrine, קטע היונים הבאים, 276.1583 מ/z, 290.1742 מ/zו- 292.1897 מ/z, בגיל NCE 35.
      הערה: רכישת נתונים MS/MS יכול להתבצע מיד לאחר MS או במועד מאוחר יותר. הרקמה אותו לעתים קרובות יכול להישאר בחוזקה לאחר MS מלא, ניתן להשתמש בהם כדי להשיג נתונים MS/MS. עם זאת, אם respraying אינו מספק אות מספיק, השתמש בממחטה חדש
  3. לטעון את קובץ שיטה MS/MS ואת קובץ נתונים בשם. הפעלת מערכת MS, ולהתחיל רכישת נתונים, הוספת ממיס במידת הצורך. כאשר שנאסף ספקטרה נאותה, בדרך כלל לאחר 30-60 s, להפסיק הרכישה.
  4. לאסוף את פיצול-אנרגיות שונות רבות בעת הקצאת פרגמנט יונים.
    הערה: מאז עלה ספריי MS חסר פרידה כרומטוגרפי, ספקטרום פיצול שיכילו יונים רבים הינם מזימות-אנרגיות שונות יעזור להביא בהירות.

6. בשם ההזדהויות על-ידי פיצול המוני טנדם ובמסתם מדויק

  1. להפוך ההזדהויות בשם על-ידי הפניה מדידות מדויקות המוני ממסדי המטבוליט זמינות בפומבי כגון Metlin21האנושי מסד Metabolome22, מסה הבנק23, מפות השומנים24, המכון הלאומי תקנים ו- MS טכנולוגיית חיפוש25, כבוד פיטוכימיקלים26, או GNPS27.
  2. כמו מסדי נתונים אלה הם לא ממצה, לבצע ביקורת ספרות נוספות על מינים מפעל כימי מאופיין לפי הצורך.
  3. התאמה יונים הפיצול מ עלה תרסיס MS/MS המאגרים הנ ל כאשר MS/MS מידע זמין, או הספרות. לחלופין, השתמש פרשנות ידנית של MS/MS פרגמנט יונים או של פיצול של תקן אותנטי שבוצעה על ידי הזרקה ישירה או LC-MS/MS.

7. ניתוח נתונים

  1. להמיר את קבצי raw של MS mzXML קבצים בעזרת הכלי msConvert Proteowizard28.
  2. השתמש חבילת התוכנה XCMS מיושם ב- R עבור שיא האיסוף. השתמש עם אינפוזיה ישירה עיבוד שיטת הריסוס עלה MS ניתוח.
    הערה: ניתן למצוא את הסקריפטים היטב המבואר המשמש לעיבוד נתונים ב- https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.
  3. כדי לקבל מדידות כמותיים למחצה, החשבונאי ההשתנות ניסיוני, לנרמל האינטנסיביות של המטבוליט כל מאת הכולל יונים הנוכחי (טיק), כמו הספריי עלה עוצמת האות MS יכול להשתנות, בין השאר בשל שייתכנו שינויים המיקום של העלה את המקור ואת הבדלי גודל וצורה של העלה.
  4. לחלופין, השתמש בתוכנה שסופק על-ידי הספק עבור ניתוח נתונים או MZmine2 (כדי ניתן למצוא ב http://mzmine.github.io/)29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ב- 10 שבועות שלאחר נביטה, שנאספו טריים שגודלו החממה ס tortuosum משאיר נותחו על ידי ריסוס העלים MS. זרימת העבודה ניסיוני עבור איתור מטבוליטים מ ס tortuosum עלים באמצעות תרסיס עלה ש-MS מודגם באיור2. עלה היה נבחר, לחתוך רצועה דקה עם קצה ישרים כדי ליצור נקודה, כשכרטיס עם התרסיס עלה המנגנון. קלאמפ תיל MS. רקמת הצמח הוצב ~ 30 מ מ מן הים יון ובהתאם x - ו y-axes. בעת אתחול של התרסיס עלה ש-MS של ס' tortuosum עלים, יונים אותרו ללא כל יישום החומר הממיס. צמחים ממשפחת Sceletium הם צמחים בשרניים עם עלים עבים עם תוכן מים גבוהה המאפשרת ספקטרומטריית electrospray יינון מאת עלה ספריי MS ללא יישום חיצוני הממס. עם זאת, ביותר בדרך כלל, רקמות הצמח דורשים יישום הממס כדי לזהות יונים.

Chronogram המוני, ספקטרה המוני מאוכלס בכבדות עם יונים הופקו לאחר 30 s של רכישת במצב חיובי יינון (איור 3). Chronogram מייצג תרסיס עלה מוצלחת MS ניסוי שבו אות יציב נשמר למשך זמן מלא של רכישת. במחקר זה, בסך הכל תשעה mesembrine אלקלואידים אותרו על ידי ריסוס העלים MS ות ז בשם שנוצרו מן המסה המדויקת של היונים protonated של בעבר מאופיין תרכובות (טבלה 1)30. . זה יתרון לבצע ריסוס העלים MS ברזולוציה גבוהה, מדויקת-המונית (HRAM) ספקטרומטר מסה, אשר מאפשר לפתור גושים מעט שונות. למשל, מ/z -262.1794 יכול להיות putatively מזוהה dihydrojoubertiamine במקום mesembrenone-מ' (demethyl - dihydro-), אשר היה על מ/z 262.1443.

רקמת העלה נשאר בחוזקה טנדם המוני (MS/MS) שאין בהם פיצול של יונים כמה עניין (טבלה 1). איור 4 מציג שלוש דוגמאות של MS/MS פיצול ספקטרה מ עלה ספריי MS, 276.1583 מ/z, 290.1742 מ/zו- 292.1897 מ/z. זהויות בשם היו מאומתים מרסיס המוני, אישר עם שברי שזוהה בעבר30. יון protonated של 276.1583 מ/z אותרו שני isomers שונים של mesembrine-M (demethyl), עוד שני isomers של mesembrenone-M בשל נוכחותם של שברי אבחון עבור כל איזומר (טבלה 1).

גם mesembrine וגם mesembrine-M (נולד ב- dihydro) היו זוהה על ידי ריסוס העלים MS, putatively המזוהה על-ידי המסה המדויקת וכן על ידי פיצול המוני. יון protonated של mesembrine-290.1742 מ/z היא אחת היונים הנפוץ ביותר בספקטרום; לכן, זה עשוי להיות מועמד סביר כמו סמן עבור מחקרים עתידיים. שני אלקלואידים הראשי של tortuosum ס הם mesembrine ו mesembrenone, אשר שניהם אותרו בקלות על ידי ריסוס העלים MS. מספר תרכובות זוהה על ידי ריסוס העלים ש-MS עשוי להיות שימושי הפיקוח על חומרים מפעל של Sceletium ומוצרים נגזר.

Figure 1
איור 1: עלה ספריי MS תרשים של הגדרת. תרסיס עלה MS הוא מטבוליט פרופיל שיטה המאפשרת דגימה מהיר של רקמות הצמח ללא פגע. הדיאגרמה מציגה תרסיס עלה MS עם מתח גבוה kV חלה עם מלחציים, אפשרות להחיל על הממס ברקמות הצמח. תרסיס עלה MS מקלה על יינון ספקטרומטריית electrospray ישירות מן הרקמה צמח לתוך הים MS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: זרימת העבודה של ספריי עלה MS ניסוי. רקמת הצמח הנבחר, עלה Sceletium tortuosum , היה לחתוך ולאחר מכן הועבר עם מלקחיים כשכרטיס ולאחר מכן ממוקם מול הים יון לפני רכישת נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: פרופיל מטבוליט של Sceletium tortuosum על ידי ריסוס העלים MS עם יינון חיובי. (א) לוח זה מציג תרסיס עלה MS chronogram המוני של הרוזן (טיק) יון סה כ. עבור כל שיא, המספר העליון הוא הזמן (דקות) והוא החלק התחתון m/z. (B) לוח זה מראה את הספריי עלה MS פרופיל מטבוליט של קשת המוני חיובי Sceletium tortuosum . שיבוץ הצגת 260-295 מ/z. ההמונים מדויק מדווחים 4 מקומות עשרוניים עם שגיאה < 6 דפים לדקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: עלה ספריי MS יינון חיובי טנדם ספקטרה המונית מן Sceletium tortuosum לחתוך עלה. מראות אלו טנדם המוני ספקטרה (MS/MS) שנאספו במצב יינון חיובית עם תרסיס עלה Putative גב' ההזדהויות של אלקלואידים עשויים מן המסה מדויק פיצול המוני הבאים: (א) mesembrine-M ו- mesembrenone-M isomers, mesembrine (B) ו- (ג) mesembrine-M (נולד ב- dihydro). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תרכובת נוסחה מולקולרית נמדד Monoisotopic מסה m/z [M + H] שגיאה ppm קטעים
Dihydrojoubertiamine 16H ג232 262.1794 5.0 N/A
Mesembrenone-M (O - demethyl-) 16H C193 274.1431 4.5 N/A
Mesembrine-M (O - demethyl-) ג16H213 276.1583 5.9 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258
Mesembrine-M (N - demethyl-) ג16H213 276.1583 5.9 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247
Mesembrenone-M (O-demethyl - dihydro-) ג16H213 276.1583 5.9 124, 205, 218, 227, 245
Mesembrenone-M (N-demethyl - dihydro-) ג16H213 276.1583 5.9 120, 151, 210, 229, 241
Mesembrenone ג17H213 288.1587 4.3 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270
Mesembrine 17H ג233 290.1742 4.9 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272
Mesembrine-M (נולד ב- dihydro) 17H C253 292.1897 5.2 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274

טבלה 1: בשם ההזדהויות של Sceletium tortuosum אלקלואידים mesembrine על ידי ריסוס העלים גברת טבלה זו דוחות על גושים מדויק יינון חיובית, פרגמנט יונים עבור אלקלואידים mesembrine Sceletium tortuosum .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השימוש המוצלח של פרוטוקול זה מסתמך על אופטימיזציה של השלבים השונים מיני צמחים, סוג הרקמה של המטרה compound(s) של עניין. שאר הפרמטרים המתוארים בפרוטוקול לספק נקודת התחלה טובה. ההחלטות ניסיוני הבאים צריך להיות עשוי ונבדק: או לא שימוש (1) לחתוך או רקמות נימולים, הממס (2) או לא ממיס, (3) מה ממיס להשתמש באמצעי מה, (4). מה המרחק של רקמות מן הים יון צריך להיות , (5) משרעת המתח. המטרה של קידום אתרים היא למצוא את התנאים המייצרים אות רציף אשר נמשך לפחות 30 s למספר דקות. התנאים צריך לספק עוצמה לשחזור והנכון אות, אשר יש צורך לבצע המסה המדויקת ומדידות MS/MS. עוצמת שידור גבוהה מושגת באמצעות תרסיס צבע מוצלחת ואמינה של יונים של הרקמה. איכות ספריי תלויה החדות של הקצה של הרקמה מופנות לכיוון הים יון, המרחק בין קצה הים רקמות, יון, המתח החשמלי מוחל. תרסיס מוצלחת תלויה מאוד החדות של הנקודה של רקמת העצה, במקרים מסוימים, הרקמה צריך להיות חתוך כדי ליצור טיפ המחודד. בפרט, שינויים קלים החדות של הזווית של הצורה מחודדות בקצה של הרקמה לחתוך יש השפעות משמעותיות על איכות וכתוצאה מכך יינון והפיק ובכך עוצמת האות7. במקרים בו רקמות כבר הצביע, ואז חיתוך לא הכרחי, כמו במקרה עם להבי העשב או עלים בצורת lancet5,13.

אות יון ניתן לדכא והניח יציב כאשר פליטת פלזמה מתרחשת מתוך הרקמה כתוצאה. מלהיות קרוב מדי לים יון או מתח חשמלי להיות גבוה מדי. מיצוב נכון של הרקמה ומבחר של מתח חשמלי נדרשים כדי להבטיח תרסיס יציבה ועקבית בין הדגימות. המרחק של הרקמה מן הים יון MS גם משפיע על האיכות והכמות של אותות המיוצר. באופן כללי, דגימת רקמה קטן צריך להיות ממוקם קרוב לים, למרות רקמה בגודל קטן לא עלולים לגרום של עוצמת אות נמוכה אם העצה הוא הצביע מאוד או תרכובות מרוכז. עוצמת והעקביות של ספקטרום צריך להיות מותאם מדעית על ידי השוואת מספר תנוחות השמה לאורך ציר z. . זה קריטי ליוניזציית מתאימים רקמת הצמח מיושר עם הים יון MS ב x - והן y-axes. עם זאת, אם רקמת הצמח שהצעה קרוב לים יון, זה יכול לדרוש ניקוי בתדירות גבוהה יותר של האופטיקה את יון ואת הקצה הקדמי של מערכת MS.

הנפח של הממס מיושם על גבי הרקמה יכולים לנוע בין 0 - 50µL בהתאם התוכן המים ואת גודל דגימת הרקמות. המקרים הוא גבוה מאוד תכולת המים ואיפה הוא נחתך, כמו במקרה של סוקולנטים Sceletium, הרקמה לא ממיס עשויים להתווסף. עם זאת, אופייני יותר להשתמש לפחות 5-10 µL של הממס עבור יישום אחד לפחות. התוספת של הממס הכרחי בעת שימוש של רקמות יבשים או טריים רקמות עם תוכן מים נמוכה כדי להקל על הריסוס. אם כמות קטנה של מרכך על חתיכה גדולה של חומר צמחי, זה סביר ייקלטו מבלי לייצר מספיק תרסיס צבע. לעומת זאת, אם אמצעי אחסון גבוה מדי, תרכובות עשוי להיות מדולל או desolvation תקין לא בקלות וביעילות תתרחש. אפשרות חלופית כדי באופן ידני pipetting ממס היא להחיל ללא הרף הממס לרקמת באמצעות מזרק משאבה, כך אות שנצפה נרקב כפונקציה של זמן כמו המתחם תיגמר גשמי הצמח10. סוגים שונים של ממסים להישפט, הספקטרום המתקבל בהשוואה לאמת כל שיפור של הכמות והעקביות של ion(s) עבור compound(s) עניין. התוספת של הממס לא רק מייצר תרסיס אלא יכול גם לספק סלקטיביות על החילוץ של תרכובות שונות. ממיסים אורגניים עם שונה בין קצוות (מתנול דיכלורומתאן, hexanes, acetonitrile, כלורופורם, אצטון) נמשל וגוררים נוכח הספקטרום זרע בוטנים8שונה באופן משמעותי יונים. באופן כללי, מתנול הוא בחירה טובה הראשון הממס, כפי הוכח לעבוד טוב בשביל לרקמות הצמח רבים ומגוון רחב של פיטוכימיקלים, כולל חומצות אמינו, אלקלואידים, flavonols, פחמימות, חומצות אורגניות, חומצות שומן של פוספוליפידים8. היישום של 100% מים על גבי רקמות הצמח נימולים לא בדרך כלל עובד טוב אבל יכולים להשתפר עם התוספת של מלחי10. במקרים רבים, בנוסף protonated יונים של תרכובת, adducts אחרים שופע מאותרים כגון נתרן ואשלגן adducts. הנוכחות של אלה מלח adducts שכיחה אפילו יותר, כאשר מלח מתווסף הממס, יכול להיות יתרון. לדוגמה, רגישות מוגברת, סלקטיביות של בעל תאים פנוליים glycosides ממינים פופולוס נצפו עם התוספת של יוני נתרן ואשלגן הממס יישומית10.

שתי מגבלות הגדולות של הזרם עלה MS הטכניקה הן (1) טווח דינמי נמוך (2) אתגרים עם כימות. בדרך כלל, רק תרכובות הנפוץ ביותר מיונן, שזיהה את הטכניקה. ירידות היעילות יינון עקב דיכוי יון המתרחשת באופן דרמטי, בהעדר הפרדה כרומטוגרפי הם פחות בעיה של מטבוליטים בשפע. כדי לעקוף מגבלה זו, ניתן להתאים את טווח סריקה להתמקד רק הטווח מ/z של ריבית. עם זאת, נמוך-שפע תרכובות עדיין ייתכן לא יזוהו ללא הפרדה וריכוז שסופקו על-ידי גזים. בניגוד כימות טיפוסי של תרכובות של תמצית, סטנדרטים פנימיים ניתן כראוי לערב אל תוך החומר הצמח לפני עלה ספריי גב' Semi-quantitative המידות ואת יחסי ריכוזים הושגו על ידי הצבת ידוע ריכוז של פתרון רגיל על פני השטח רקמות, ואז השירי להתייבש לפני עלה תרסיס MS ניתוח8,9,31. לדוגמה, שיטת הוספה סטנדרטית כימות שימש לחישוב היחס של יונים נציג עבור תקן פנימי כדי יונים עניין לקבוע יחסי כמויות32. עקומת כיול שימש כדי להעריך את הריכוז היחסי. באמצעות שיטה זו, היה אפשר להשוות את היחס שבין glycosides שונים כדי פנימי סטנדרטי, rebaudioside D, הריכוז היחסי של glycosides ספציפי יכול מכן לחשב בתוך Steבאמצעות עלים33. לחלופין, כימות מדויקת יותר אפשרי עם תקן שכותרתו isotopically של המתחם של עניין, למרות הזמינות המסחרית עשויה להיות אתגר. השימוש של רקמות הצמח סמויה עם תוויות יכול גם לשפר את כימות עם שיטה זו34.

בהתחשב בכך קונבנציונאלי LC-MS/MS דורשת הכנת הדוגמא נרחב והפרדה כרומטוגרפי, שיטות אחרות לניתוח הם לעיתים קרובות הרצוי. תרסיס עלה MS היא טכניקה ניתוח כימי ישיר ניתן להחיל בקלות, ומציע פשטות, דיוק, דיוק, מטבוליט מהירה זיהוי, כימות למחצה. מסיבה זו, חקרנו והתאמתו עלה ספריי MS כדי לפקח על התוכן כימי של S. tortuosum, אשר עשוי לספק את הבסיס chemotaxonomic כלים כדי להבדיל בין המינים של הסוג Sceletium מבוסס על הביוכימי חתימות. מספר מאפיינים אנטומיים של צמח זה לעשות את זה הדגימה הבדיקה האידיאלית לריסוס עלה MS. זה צמח בשרני, המכילים כמויות גבוהות של מים, אשר יש יתרון התרסיס יכול להיווצר ללא היישום החומר הממיס. עלה Sceletium מכיל idioblasts (תאים דמויי שלפוחית השתן)15 אשר לשמש עתודות אחסון שבו מטבוליטים מיוחדים עלולים להצטבר. תרסיס עלה MS הוא שיטת ניתוח ויוו לאפיין רקמות הצמח באופן מהיר. הטכניקה כללי חל מיני צמחים רבים, סוגי רקמות ואת מחלקות של תרכובות. טכניקות ללכוד מידע על תרכובות צמחים הם עניין רב כדי להבין את המפעל העיקרי ממוקצעות חילוף החומרים לשימושים האנושי של בריאות, תזונה, חקלאות, אנרגיה35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומן על ידי המענק תכנית המחקר הגנום של צמח ה-NSF IOS-1238812, בתר ב ביולוגיה IOS-1400818. העבודה גם מומן על ידי מלגת סטודנט לתואר שני מונסנטו כדי קתרין א Sammons. אפריקה חוקר חוקרים תוכנית פולברייט (2017-2018) הוא הודה על מימון הוענק Nokwanda פ Makunga. אנו מעריכים מאוד את התרומה של מקור nanospray של ג'סיקה Prenni ואת המתקן פרוטאומיקס, גליקומיקס באוניברסיטת קולורדו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conn Pin Digi-Key elctronics WM2563CT-ND pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp Digi-Key elctronics 314-1018-ND CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp Digi-Key elctronics 290-1951-ND ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink Digi-Key elctronics Q2Z1-KIT-ND to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software Thermo scientific Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  2. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
  3. Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
  4. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  5. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  6. Chan, S. L. -F., Wong, M. Y. -M., Tang, H. -W., Che, C. -M., Ng, K. -M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
  7. Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
  8. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  9. Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
  10. Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
  11. Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
  12. Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
  13. Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
  14. Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
  15. Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
  16. Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
  17. Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
  18. Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
  19. Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
  20. Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
  21. Metlin. , Available from: http://metlin.scripps.edu (2018).
  22. Human Metabolome Database. , Available from: http://www.hmdb.ca/ (2018).
  23. Mass Bank. , Available from: http://www.massbank.jp/?lang=en (2018).
  24. Lipid Maps. , Available from: http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html (2018).
  25. National Institute of Standards and Technology MS Search. , Available from: http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/ (2018).
  26. ReSpect. , Available from: http://spectra.psc.riken.jp/ (2018).
  27. GNPS. , Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018).
  28. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
  31. Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
  32. Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate? Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
  33. Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
  34. Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
  35. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 136 עלה ספריי MS ספקטרומטר מסה יינון ספקטרומטריית electrospray יינון אמביינט Sceletium tortuosum mesembrine אלקלואידים מוצרי טבע צמחים מטבוליטים קטן מולקולות
ספקטרומטר מסה של ספריי עלה: טכניקה מהירה יינון אמביינט להעריך ישירות מטבוליטים רקמות הצמח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Freund, D. M., Sammons, K. A.,… More

Freund, D. M., Sammons, K. A., Makunga, N. P., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues. J. Vis. Exp. (136), e57949, doi:10.3791/57949 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter