رواية تقنية جراحية كأساس في فيفو جزئي الهندسة الكبد في الفئران
Summary
نقوم بإنشاء تقنية جراحية رواية لنموذج نضح فص كبد واحد في فيفو في الفئران كشرط مسبق لمواصلة دراسة في فيفو الكبد الجزئي الهندسية في المستقبل.
Abstract
هندسة الجهاز هو استراتيجية رواية لإنشاء جهاز الكبد البدائل التي يمكن أن تستخدم في زرع الأعضاء. في الآونة الأخيرة، في فيفو الكبد الهندسية، بما في ذلك في فيفو الجهاز ديسيلولاريزيشن تليها إعادة تعمير، برزت نهجاً واعداً أكثر السابقين فيفو الكبد الهندسة. ومع ذلك، لم يتحقق البقاء على قيد الحياة بعد العملية الجراحية. الهدف من هذه الدراسة تطوير تقنية جراحية رواية من فيفو نضح انتقائية فص الكبد في الفئران كشرط مسبق للهندسة في فيفو الكبد. ونحن توليد تجاوز دائرة إلا من خلال الفص الجانبي الأيسر. ثم، هو perfused الفص الجانبي الأيسر مع هيبارينيزيد المالحة. يتم إجراء التجربة مع أربع مجموعات (n = 3 الفئران كل مجموعة) استناداً إلى أوقات مختلفة نضح 20 دقيقة، ح 2، ح 3، وحاء 4 البقاء على قيد الحياة، فضلا عن تغيير لون الميكروسكوب مرئية وغياب العزم الأشيع من خلايا الدم في ثالوث المدخل والكبدية، تؤخذ كمؤشر لإنشاء نموذج ناجح. بعد نضح الانتقائي للفص الجانبي الأيسر، نلاحظ أن الفص الجانبي الأيسر، الواقع، تحولت من اللون الأحمر إلى أصفر باهت. وفي تقييم النسيجي، لا خلايا الدم مرئية في الفرع في الوريد البابي والوريد المركزي وفي الجيوب. الفص الجانبي الأيسر أحمرا بعد إعادة فتح الأوعية المحجوبة. نجا 12/12 الفئران الإجراء لأكثر من أسبوع واحد. ونحن الأول من يقدم نموذجا جراحية في فيفو نضح فص كبد واحد بفترة طويلة البقاء على قيد الحياة لأكثر من أسبوع واحد. على عكس التقرير المنشور سابقا، أهم ميزة لهذه التقنية المقدمة هنا أن الحفاظ على التروية 70 ٪ من الكبد في جميع أنحاء الإجراء بأكمله. إنشاء هذا الأسلوب يوفر أساسا في فيفو جزئي الهندسة الكبد في الفئران، بما في ذلك ديسيلولاريزيشن وريسيلولاريزيشن.
Introduction
المؤشرات لزرع آخذة في التوسع باستمرار. وفي المقابل، معدلات التبرع بالجهاز والجودة الشاملة للأجهزة آخذة في الانخفاض، مما أدى إلى زيادة طلب على الطعوم. واستمر عدد المرشحين إضافة إلى قائمة الانتظار لعملية زرع كبد لزيادة (مثلاً، في الولايات المتحدة، وأضيفت المرضى 11,340 في عام 2016، مقارنة مع 10,636 في عام 2015)1. وعلى الرغم من جهود كبيرة، على عدد الأجهزة المتوفرة لا تلبي الاحتياجات السريرية. بسبب ازدياد نسبة الإصابة بأمراض الكبد، تتوفر العديد من المرضى مع نهاية مرحلة من أمراض الكبد يموت على قائمة الانتظار لزرع قبل جهازا مانحة. لتلبية الطلب الهائل ترقيع المانحة الكبد، اتباع نهج بديلة باستخدام أنسجة الكبد مبادئ الهندسة يجري بنشاط2. في الوقت الحاضر، تقنية بيولوجية المطورة حديثا للهندسة الكبد يمكن أن يحتمل أن التغلب على هذا النقص.
هندسة الكبد يتكون من خطوتين: توليد سقالة اللاخلوي، متبوعاً بتعمير من السقالة. للحصول على سقالة كبد اللاخلوي بيولوجية، هو الكبد اكسبلانتيد perfused عبر نظام الأوعية الدموية مع المنظفات الأيونية أو النطاق، يمكن إزالة المواد الخلوية من الكبد. في معظم الدراسات السابقة، قد حققت سقالة كبد اللاخلوي بيولوجية نضح الكبد مع مزيج من دوديسيل كبريتات الصوديوم و TritonX100. كنتيجة لذلك، تم إزالة كافة الخلايا، بينما أبقى على هيكل المصفوفة خارج الخلية. وقد ريسيديد السقالات الجهاز مع خلايا ناضجة وسرطانه الخلية، فضلا عن خطوط الخلايا البطانية، وخلايا الكبد الأولية مع أو بدون التطبيق المتزامن لخلايا بطانية أو الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC). معظم الباحثين تركز على السابقين فيفو الكبد الهندسية3،4،5،6،،من78،9،10، 11،12،،من1314. ومع ذلك، في معظم الدراسات السابقة، تم زرع فقط من القطع الصغيرة من مكعبات سقالة repopulated في مواقع مختلفة من زرع هيتيروتوبيك. في عدد قليل من الدراسات، تم زرع السقالات repopulated الجزئية كالابتزاز مساعدة. ومع ذلك، كان الوقت بقاء المبلغ الأقصى8،ح 72 فقط14. وبقدر ما نعلم، زرع أورثوتوبيك من طعم كبد كامل repopulated لم تم تنفيذها أو نشرت حول. مهمة طويلة الأجل وزرع الأعضاء هندسيا لا تزال في مراحلها الأولى. ولذلك، هناك حاجة إلى نهج بديل للهندسة السابقين فيفو الكبد.
الهندسة في فيفو الكبد قد تمثل بديلاً لدراسة إعادة تعمير الكبد تحت الظروف الفسيولوجية. وتتعدد مزايا في فيفو الكبد الهندسة مقارنة ب السابقين فيفو الكبد الهندسة. في فيفو repopulated الجزئي الكبد سقالة يخضع التروية الدموية الفسيولوجية مع درجة حرارة مناسبة وكافية الأوكسجين والمغذيات وعوامل النمو على عكس السابقين فيفو التروية مع الاصطناعية الثقافة المتوسطة. وعلاوة على ذلك، يحتفظ الكبد العادي الجزئية المتبقية وظيفة الكبد، أساسا السماح ببقاء على المدى الطويل. منذ ما زالت عاجزة عن الحفاظ على بقاء على المدى الطويل من الحيوانات التجريبية التي لها وظيفة الكبد8مزروع السابقين فيفو هندسيا كبد الاختلاس، نحن نتصور أن في فيفو الجزئي الكبد انجينيرينجوولد تصبح في نهاية المطاف نموذج واعدة مزيد من الدراسة تطور كبد هندسيا مع الملاحظات البقاء على قيد الحياة أطول من السابقين فيفو.
مؤخرا، قدمت مجموعة بحوث (عموم والزملاء)، للمرة الأولى، تقنية في فيفو الكبد الهندسة15. أنهم حققوا نضح معزولة من الفص الكبد أدنى حق في الفئران الحية على الرغم من التحديات التشريحية والتقنية. وأفادوا بالمضاعفات والنتائج الأولى لتعمير في فيفو على استخدام خط خلية الأولية تتمثل الفئران. ومع ذلك، نموذج نضح الجراحية في فيفو لعموم et al. له العيوب. أنهم حققوا نضح واحد فص الكبد في الفئران على حساب حجب تماما بالوريد البابي وأدنى الوريد الأجوف، مما قد يسبب أذى شديدا للحيوان. كانت التضحية الفئران التجريبية بعد 6 ساعات فقط من وقت الملاحظة الموضعية. ولذلك، تقنية التروية فص الكبد في فيفو يحتاج إلى مزيد من التحسين لتحقيق البقاء على قيد الحياة بعد العملية الجراحية.
قمنا بتطوير نموذج رواية البقاء على قيد الحياة في فيفو نضح فص الكبد، استناداً إلى الدراسات السابقة لتشريح الفئران16، تقنية cannulation الوريد البابي لرصد الفسيولوجية في الفئران17، والهندسة الحيوية الكبد الكبد 18 , 19-الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء موضحة في الشكل 1A – 1E.
هذا الأسلوب مناسبة لأولئك الذين يريدون استخدام هذا النموذج نضح التجريبية في فيفو للبحوث الأساسية بشأن معاملة الجهاز الجزئي بالحقن بالمخدرات، و في فيفو ديسيلولاريزيشن بتر كيميائية لأمراض الجهاز (مثلاً ، سرطان الكبد)، في فيفو ثقافة الخلية في مصفوفة ديسيلولاريزيد مقارنة السابقين فيفو ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد خلية ثقافة نظم20،21،،من2223 , 24 , 25 , 26، و في فيفو الكبد الهندسية التي ديسيلولاريزيشن وإعادة تعمير.
Protocol
Representative Results
Discussion
بحظر وكانولاتينج الوريد البابي الأيمن مع قسطرة كمدخل السوائل والوريد الكبدي الجانبي الأيسر قسطرة أخرى كمنفذ للسوائل، ونحن بنجاح إنشاء في فيفو السوائل التفافية داخل الفص الجانبي الأيسر، مما يدل على أن على الرغم من أن التقنية التي تنطوي على تحد كبير بسبب الحجم الصغير لهذه السفن كانول…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر ينز جيلينج من معهد التشريح الأول، مستشفى جامعة يينا، لإنتاج رسومات تخطيطية لتشريح الجرذ الكبد.
Materials
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon | ||
Riferimenti
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
