Роман хирургической техники как основы для в естественных условиях частичной печени инженерии в крыса
Summary
Мы устанавливаем Роман хирургической техники для модели перфузии в естественных условиях один лепесток печени крыс как предпосылкой для дальнейшего обучения в естественных условиях частичной печени техники в будущем.
Abstract
Орган инженерия — это роман стратегия для создания в трансплантации печени орган заменителей, которые потенциально могут быть использованы. Недавно, в естественных условиях печени инжиниринг, в том числе в vivo орган decellularization следуют заселения, стала перспективный подход над ex vivo печени инженерии. Однако послеоперационные выживания не была достигнута. Цель этого исследования – разработать Роман хирургической техники в vivo перфузии выборочной доли печени крыс как предпосылки в vivo печени инженерии. Мы генерируем обходной цепи только через левой боковых лепестков. Затем левой боковых лепестков увлажненную с гепаринизированным засолены. Эксперимент проводится с 4 группы (n = 3 крысы на группу) на основе различных перфузии раз 20 мин, 2 ч, 3 h и 4 ч. выживание, а также макроскопически видимое изменение цвета и гистологически определяется отсутствие клеток крови в Портал триады и синусоиды, воспринимается как индикатор для создания успешной моделью. После выборочной перфузии левой боковых лепестков мы отмечаем, что левой боковых лепестков, действительно, оказался от Красного слабый желтый. В гистологических оценки не клетки крови видны в ветви воротной вены, Центральной Вены и синусоид. После открытия заблокированных судов становится красным левой боковых лепестков. 12/12 крыс выжил процедура для более чем одной недели. Мы являемся первым сообщить хирургической модель в vivo перфузии один лепесток печени с периодом долгое выживание более чем за одну неделю. В отличие от ранее опубликованном докладе, это самое важное преимущество техники, представленные здесь перфузии 70% печени поддерживается на протяжении всей процедуры. Создание этой техники обеспечивает основу для в естественных условиях частичной печени техники в крыс, включая decellularization и recellularization.
Introduction
Постоянно расширяются показания для трансплантации. В отличие от этого орган пожертвование ставки и общее качество органов сокращается, ведущих к растущего спроса на графтов. Продолжало увеличиваться число кандидатов, добавляется в список ожидающих пересадки печени (например, в Соединенных Штатах, 11,340 пациентов были добавлены в 2016 году, по сравнению с 10,636 в 2015 году)1. Несмотря на значительные усилия число имеющихся органов не отвечают клинических потребностей. Из-за повышенной заболеваемости печени у многих пациентов с терминальной стадии заболевания печени умирают в списке ожидания пересадки до доноров орган становится доступной. Для удовлетворения огромного спроса на донорской печени графтов, альтернативные подходы, с помощью ткани печени, инженерные принципы в настоящее время активно проводит2. В настоящее время недавно разработанный биологических техника печени техники потенциально можно преодолеть этот недостаток.
Печени инженерии состоит из двух этапов: поколение бесклеточной эшафот, следуют заселение эшафот. Для получения биологических бесклеточной печени леску, explanted печень является перфузии через сердечно-сосудистой системы с ионной или неионогенных моющих средств, которые можно удалить клеточного материала из печени. В большинстве предыдущих исследований биологические бесклеточной печени леску достигалось перфузии печени с сочетанием лаурилсульфат натрия и TritonX100. В результате все клетки были удалены, в то время как структура внеклеточная матрица была сохранена. Подмости органа были заполнения с зрелые клетки, гепатоцеллюлярной, а также линии эндотелиальных клеток и первичных гепатоцитов с или без одновременного применения эндотелиальных клеток или мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Большинство исследователей сосредоточиться на ex vivo печени инженерных3,4,5,6,,78,9,10, 11,12,,1314. Однако в большинстве предыдущих исследований, только небольшие кусочки перезаполняется эшафот кубики были пересажены в различных heterotopic имплантации сайтов. В нескольких исследованиях частичное перезаполняется леса были пересажены как вспомогательные трансплантата. Однако время максимальной сообщил выживания был только 72 h8,14. Насколько мы знаем, трансплантация ортотопическая repopulated полный печени трансплантата еще не были выполнены или публикации о. Еще в младенческом долгосрочные функции и трансплантации органов инженерии. Таким образом требуется альтернативный подход к конструированию ex vivo печени.
В естественных условиях печени инженерия может представлять альтернатива для изучения печеночная заселение в физиологических условиях. Преимущества в vivo печени техники по сравнению с ex vivo печени инженерных многообразны. В естественных условиях перезаполняется частичной печени эшафот подвергается перфузии крови физиологических с надлежащей температуры, достаточно кислорода, питательных веществ и факторов роста в отличие от ex vivo перфузии с искусственной питательной среды. Кроме того остальные частично нормальной печени поддерживает функцию печени, главным образом позволяя долгосрочного выживания. Поскольку еще не в состоянии поддерживать долгосрочное выживание экспериментальных животных, его функции печени8имплантированных ex vivo инженерии печени трансплантата, мы предполагаем, что в естественных условиях частичной печени engineeringwould в конечном итоге стать перспективные модели для дальнейшего изучения эволюции инженерии печень с длительного выживания наблюдений чем ex vivo.
Недавно один исследовательская группа (Pan и коллеги) в первый раз, представил технику в vivo печени инженерных15. Они достигли изолированной перфузии правой нижней доли печени в жизни крыс несмотря на анатомических и технические проблемы. Они сообщили, интраоперационная первые результаты в vivo заселение с помощью линии клеток первичного гепатоцитов крыс. Однако в естественных условиях хирургического перфузии модель Пан et al. есть недостатки. Они достигли перфузии один лепесток печени крыс за счет полностью блокируя воротной вены и нижней полой вены, которые могут причинить серьезный ущерб для животного. Экспериментальных крыс были принесены только после 6 часов времени интраоперационной наблюдения. Таким образом метод печени доли перфузии в естественных условиях требует дальнейшего улучшения добиться послеоперационных выживания.
Мы разработали модель Роман выживания в vivo печени доли перфузии, основанные на предыдущих исследований анатомии печени крыс16, техника катетеризации портальной вены для мониторинг гемодинамики в мышей17и печени биоинженерии 18 , 19. Ключевые шаги в процедуре приведены на рисунке 1A – 1E.
Этот способ подходит для тех, кто хочет использовать этот экспериментальный в vivo перфузии модель для фундаментальных исследований по частичной Органосохраняющая тактика лечения инфузии с наркотиками, в естественных условиях decellularization как химические резекции заболеваний органа (например , рак печени), в естественных условиях клеточной культуры в decellularized матрицу, сравнивая ex vivo двумерные и трехмерные клетки культуры систем20,21,,2223 , 24 , 25 , 26и в естественных условиях печени инженерных decellularization и заселения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Блокирование и cannulating левой воротной вены с катетером как жидкости впуска и левой боковой печеночной вены с другой катетер как жидкости розетки, мы успешно созданы в vivo жидкости объездной в левой боковых лепестков, показывая, что Хотя метод является крайне сложной из-за небольшого …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Jens Geiling из Института анатомии я, Йена университетской больницы, для производства схематические чертежи Анатомия печени крыс.
Materials
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon | ||
Riferimenti
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
