Uma nova técnica cirúrgica como fundamento na Vivo parcial engenharia fígado de rato
Summary
Estabelecemos uma nova técnica cirúrgica para um modelo de perfusão na vivo único lóbulo hepático em ratos como um pré-requisito para estudar mais na vivo parcial fígado engenharia no futuro.
Abstract
Órgão engenharia é uma estratégia nova para gerar substitutos de fígado órgão que potencialmente podem ser usados em transplante. Recentemente, na vivo fígado de engenharia, incluindo no vivo órgão decellularization seguido de repovoamento, emergiu como uma abordagem promissora sobre ex vivo fígado engenharia. No entanto, a sobrevivência pós-operatória não foi alcançada. O objetivo deste estudo é desenvolver uma nova técnica cirúrgica na vivo perfusão seletiva lóbulo hepático em ratos como um pré-requisito para engenharia na vivo hepática. Geramos um bypass do circuito somente através do lóbulo lateral esquerdo. Então, o lobo lateral esquerdo é perfundido com solução salina heparinizada. O experimento é executado com 4 grupos (n = 3 ratos por grupo) com base em tempos diferentes de perfusão de 20 min, 2h, 3h e 4h. sobrevivência, bem como a alteração macroscopicamente visível de cor e histologicamente determinada ausência de células do sangue na Tríade portal e os sinusoides, é tomado como um indicador para um estabelecimento de modelo de sucesso. Após a perfusão seletiva do lobo esquerdo lateral, observamos que o lobo lateral esquerdo, com efeito, tornou-se de vermelho amarelo fraco. Em uma avaliação histológica, sem glóbulos são visíveis no ramo da veia porta, a veia central e os sinusoides. O lobo lateral esquerdo fica vermelho após a reabertura dos vasos bloqueados. 12/12 ratos sobreviveram o procedimento por mais de uma semana. Nós somos os primeiros a relatar um modelo cirúrgico na vivo único lóbulo hepático da perfusão com um período de tempo de sobrevivência de mais de uma semana. Em contraste com o relatório publicado anteriormente, a vantagem mais importante da técnica apresentada aqui é que a perfusão de 70% do fígado é mantido durante todo o processo. O estabelecimento desta técnica fornece uma base em vivo parcial engenharia hepática em ratos, incluindo decellularization e recellularization.
Introduction
As indicações para a transplantação de órgãos estão em constante expansão. Em contraste, taxas de doação de órgãos e qualidade geral dos órgãos estão em declínio, levando a uma crescente demanda por enxertos. O número de candidatos adicionado à lista de espera de transplante de fígado continuou a aumentar (por exemplo, nos Estados Unidos, 11.340 pacientes foram adicionados em 2016, em comparação com 10.636 em 2015)1. Apesar dos esforços consideráveis, o número de órgãos disponíveis não satisfaz necessidades clínicas. Devido o aumento da incidência de doença hepática, muitos pacientes com estágio final morrem de doenças hepáticas na lista de espera de transplante antes um órgão doado se torna disponível. Para atender a enorme demanda por enxertos de doadores de fígado, abordagens alternativas usando o tecido hepático, princípios de engenharia estão a ser activamente prosseguido2. Hoje em dia, uma recém-desenvolvida técnica biológica de fígado engenharia potencialmente poderia superar esta falta.
Engenharia de fígado consiste em duas etapas: a geração de um andaime acelular, seguido de um repovoamento do cadafalso. Para obter um biológico acelular andaime de fígado, o fígado explantado é perfundidos através do sistema vascular com detergentes não iônicos ou iônicos, que pode remover o material celular do fígado. Na maioria dos estudos anteriores, um andaime de fígado acelular biológico foi alcançado por perfusão do fígado com uma combinação de Dodecil sulfato de sódio e TritonX100. Como resultado, todas as células foram removidas, Considerando que foi mantida a estrutura da matriz extracelular. Os andaimes de órgão foram novamente propagados com células maduras, hepatocelular, bem como linhas de células endoteliais e hepatócitos primários com ou sem a aplicação simultânea de células endoteliais ou células-tronco mesenquimais (MSC). Mais foco de pesquisadores em ex vivo fígado engenharia3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. No entanto, na maioria dos estudos anteriores, apenas pequenos pedaços de cubos de andaime repovoado foram transplantados em sites diferentes de implantação heterotópica. Em alguns estudos, andaimes repovoados parciais foram transplantadas como um enxerto de auxiliar. No entanto, o tempo máximo de sobrevivência relatada foi somente 72 h8,14. Tanto quanto sabemos, transplante ortotópico de um enxerto repovoado fígado completo ainda não foi executada ou publicado sobre. A função a longo prazo e a transplantação de órgãos projetados estão ainda em sua infância. Portanto, uma abordagem alternativa para ex vivo fígado engenharia é necessária.
Na vivo fígado engenharia pode representar uma alternativa para estudar o repovoamento hepático sob condições fisiológicas. As vantagens da engenharia na vivo fígado comparado com ex vivo fígado engenharia são múltiplas. Na vivo repovoada parcial fígado cadafalso é submetido a perfusão de sangue fisiológico com temperatura adequada, suficiente oxigênio, nutrientes e fatores de crescimento, em contraste com perfusão ex vivo com meio de cultura artificial. Além disso, o fígado normal parcial restante mantém a função hepática, principalmente permitindo a sobrevivência a longo prazo. Desde que um enxerto fígado implantado ex vivo engenharia é ainda incapaz de sustentar a sobrevivência a longo prazo dos animais experimentais por sua função hepática8, nós encaramos na vivo parcial fígado engineeringwould, finalmente, tornar-se um modelo promissor para um estudo mais aprofundado da evolução da engenharia fígados com observações de sobrevivência mais longos do que ex vivo.
Recentemente, um grupo de pesquisa (Pan e colegas) apresentou, pela primeira vez, uma técnica de fígado na vivo 15de engenharia. Eles alcançaram a perfusão isolada do lóbulo inferior direito fígado em ratos vivos apesar de desafios técnicos e anatômicos. Eles relataram os primeiros resultados no intra-operatório de repovoamento em vivo usando uma linha de celular de hepatócitos primários de rato. No entanto, o modelo de perfusão cirúrgica na vivo de Pan et al tem desvantagens. Eles alcançaram a perfusão único lóbulo hepático em ratos em detrimento de bloquear completamente a veia porta e veia cava inferior, que pode causar danos graves ao animal. Os ratos experimentais foram sacrificados após apenas 6 horas de tempo de observação intra-operatória. Portanto, a técnica de perfusão de fígado lobo na vivo mais precisa de melhoria para alcançar sobrevivência pós-operatória.
Desenvolvemos um modelo de sobrevivência romance na vivo perfusão de fígado lobo, com base em estudos anteriores da anatomia hepática do rato16, a técnica de canulação de veia porta para Monitorização hemodinâmica em ratos17e fígada bioengenharia 18 , 19. as principais etapas para o procedimento estão ilustradas na figura 1A – 1E.
Esta técnica é apropriada para aqueles que querem usar este modelo de perfusão experimental na vivo para a pesquisa básica no tratamento do órgão parcial por infusão com drogas, na vivo decellularization como uma ressecção química para doenças do órgão (por exemplo, , câncer de fígado), na vivo cultura de células em uma matriz de decellularized comparando ex vivo bidimensional e tridimensional de células cultura sistemas20,21,22,23 , 24 , 25 , 26e na vivo fígado engenharia por decellularization e repovoamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Através do bloqueio e canulação da veia porta esquerda com um cateter como uma entrada de fluido e a veia hepática lateral esquerda com outro cateter como uma saída de fluido, com êxito geramos na vivo desvio fluido dentro do lóbulo lateral esquerdo, indicando que Embora a técnica é altamente desafiadora devido ao tamanho pequeno dos vasos para canulação e um alto risco de causar hemorragia, é viável. Até os ratos passando por um período longo de perfusão de 4 horas sobreviveram pelo menos 1 sema…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer Jens Geiling do Instituto de anatomia eu, Hospital da Universidade de Jena, para produzir os desenhos esquemáticos da anatomia do fígado de ratos.
Materials
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon | ||
Riferimenti
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