Toluïdine blauwe verkleuring van de hars-ingebedde secties voor evaluatie van de morfologie van de perifere zenuwen
Summary
Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van fijne structuren van perifere zenuwen door verkrijgen en 1-2 µm secties met toluïdine blauwe vlekken
Abstract
Perifere zenuwen uit te breiden door het hele lichaam, innervating onderzoeken weefsels met motorische of sensorische axonen. Als gevolg van wijdverspreide distributie, zijn perifere zenuwen vaak beschadigd als gevolg van trauma of ziekte. Zoals methoden en strategieën zijn ontwikkeld om te beoordelen van de perifere zenuw verwonding in diermodellen, functie en regeneratie, analyseren van de morphometry van de perifere zenuw geworden een essentiële terminal resultaten meting. Toluïdine blauwe verkleuring van de zenuw cross-secties verkregen uit hars ingesloten zenuw secties is een reproduceerbare methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve evaluaties van de perifere zenuwen, waardoor de visualisatie van morfologie axonen aantal en de mate van myelinisering. Deze techniek, kan zoals bij vele andere histologische methoden, moeilijk zijn om te leren en meester gebruikt standaard geschreven protocollen. De bedoeling van deze publicatie is daarom te accentueren schriftelijke protocollen voor toluïdine blauwe verkleuring van de perifere zenuwen met videografie van de methode, met behulp van de ischiadicus zenuwen geoogst van ratten. In dit protocol, beschrijven we in vivo de fixatie van de perifere zenuwen en de collectie van het weefsel, en na fixatie met 2% osmium tetroxide, inbedding van zenuwen in epoxyhars, en ultramicrotome segmenteren van zenuwen tot 1-2μm dikte. Zenuw secties vervolgens overgebracht naar een glasplaatje en gekleurd met toluïdine blauw, waarna ze zijn kwantitatief als in kwalitatief opzicht beoordeeld. Voorbeelden van de meest voorkomende problemen worden weergegeven, evenals stappen voor deze problemen.
Introduction
Perifere zenuwen uitbreiden door het lichaam, innervating onderzoeken weefsels met motorische of sensorische axonen1 Perifere zenuwen defecten veroorzaakt door medische aandoeningen en trauma vertegenwoordigen een belangrijke openbare gezondheids-zorg en hebben grote economische gevolgen2,3. Ondanks de vooruitgang bij het beoordelen van de resultaten van de perifere zenuw letsel en begrip van de zenuw regeneratie, zijn traditionele methoden zoals zenuw histologie en kleuring technieken essentiële instrumenten om kwalitatief en kwantitatief beoordelen van zenuw-gezondheid Als een terminal resultaten meting in diermodellen of verwijderde menselijk weefsel. Dit is vaak gekoppeld aan elektrofysiologische metingen van perifere zenuwen functie, waar de morphometry onthullen kan waarom functionele zenuw regeneratie deed of zich niet heeft voorgedaan.
Toluïdine blauwe verkleuring van de hars ingesloten perifere zenuwen semi-dunne secties is een gespecialiseerde methode voor imaging-myelinated zenuwvezels, verstrekken van hoge kwaliteit en heldere gedetailleerde beelden van zenuw structuren4,5,6 . Toluïdine blauw is een acidophilic Metachromatische vlek, ontdekt door William Henry Perkin in 18567, en is gebruikt in diverse medische toepassingen8. Toluïdine blauw gebeitste perifere zenuwen secties verkregen zenuw hars-ingebedde segmenten voorziet in duidelijke visualisatie van zenuw structuren. Visualisatie van de myelineschede structuur kan worden verbeterd door het gebruik van osmium tetroxide na fixatie4,9. Osmium-tetroxide is een giftige oxidator en lipide kleefpoeders agent die samenwerkt met de dubbele bindingen in lipiden, wat resulteert in duidelijk gedefinieerde lipide-rijke myeline omhulsels10. Osmium tetroxide is echter giftig, dure, vereist een langere incubatietijd van zenuw segmenten, en niet altijd wordt gebruikt.
Alternatieve methoden van verwerking en vlekken zijn ontwikkeld voor de visualisatie van de morfologie van de perifere zenuw; Paraffine, cryogene afdelen en epoxy hars-embedded zenuw afdelen gevolgd door kleuring met toluïdine blauw of fenyleendiamine oplossing heeft geweest tweedehands voor het kwantificeren van de morfologische veranderingen van perifere zenuw regeneratie 11,12 . Deze methoden hebben hun voordelen en opbrengst essentiële gegevens over het aantal axonen, myeline dikte, diameter van de axon en axon diameter tot en met myelinated vezel diameter (g-ratio) 11,13,14,15 .
Het primaire onderscheid van de hars inbedding in dit protocol is dat het verkrijgen van 1-2 μm dikte dwarsdoorsneden vanwege de hardheid van de hars vergemakkelijkt met behoud van de histologische kwaliteiten van de zenuw. Deze dunne secties, in tegenstelling tot de 4-5 μm dikte secties verkregen paraffine insluiten, bieden perifere zenuwen secties met een hogere resolutie, waardoor een nauwkeuriger kwantificering van axon myelinisering, zoals de g-ratio, die niet kan worden dikkere secties16verkregen. Terwijl cryogene afdelen kan worden gebruikt voor het verkrijgen van 1-2 µm secties, is het onze ervaring dat het moeilijker te verkrijgen van secties zonder talrijke grote barsten is geweest. Deze gebarsten secties kunnen leiden tot onjuiste telling van het aantal axonen en aspecten van myelinisering.
Naast toluïdine blauw kleuring17, kan een silver kleuring methode18 en Masson van trichrome kleuring4 ook worden gebruikt om te laten zien van de zenuw axonen. Echter, met behulp van hars inbedding van rat mediane zenuw secties gekleurd met haematoxyline en eosine of Masson van trichrome toonde vaag myeline omhulsels en niet-herkende structuren, overwegende dat toluïdine blauw kleuring duidelijk myelineschede beeld toonde en gemakkelijk kan worden gekwantificeerde4. Ondanks enkele beperkingen, toluïdine blauwe verkleuring van de hars ingesloten perifere zenuwen is een waardevolle techniek die kan worden gebruikt wanneer de hoge resolutie opnamen van zenuw morfologie zijn vereist.
Het primaire nadeel voor het insluiten van de hars is dat het is tijdrovend en niet mogelijk is om immunokleuring van het hetzelfde weefsel als gevolg van de moeilijkheid van het antigeen ophalen in vergelijking met paraffine en bevroren ingesloten secties technieken. Het is dus niet in het algemeen kunnen gebruik maken van het zelfde weefsel voor immunokleuring dat wordt verwerkt via hars-insluiting voor toluïdine blauw kleuring. Hoewel niet gebruikt hier, immunohistochemistry is desgewenst in de hars ingesloten secties, het gebruik van glycol methacrylaat harsen te embedding zorgt voor immunohistochemistry op weefselsecties moeten worden uitgevoerd, maar het is relatief duur19. Dit kan enigszins worden verzacht door het snijden van de perifere zenuw in afzonderlijke segmenten, sommige voor het insluiten van hars en anderen voor immunokleuring direct na fixatie.
Het proces van toluïdine blauwe verkleuring van de hars ingesloten perifere zenuwen, zoals met meest histopathologisch analyse, kan worden opgesplitst in vijf fasen, met inbegrip van fixatie, uitdroging, insluiten, afdelen en kleuring van20. Wij willen hier een protocol en praktische leidraad voor het gebruik van hars ingesloten rat nervus ischiadicus secties gekleurd met toluïdine blauw te verwerven hoge kwaliteitsbeelden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Examens van de morfologische structuur van het perifere zenuw verwonding en regeneratie zijn frequente onderwerpen van studie13. In dit protocol beschrijven we de stappen voor het verkrijgen van hoge kwaliteitsbeelden voor histologische ondermeer met behulp van rat nervus ischiadicus weefsel ingebed in hars blokken en met toluïdine blauw gekleurd. Deze techniek geeft een beeld van de morfologie van de zenuw waarin de zenuw regeneratie kan worden gekwantificeerd door het meten van het aantal axone…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs wil thankthe Jenkins microscopie faciliteit bij de Universiteit van Wyoming voor hun hulp, en de leden van de Bushman lab, Kelly Roballo, Hayden waarheidsgetrouw, Wupu Osimanjiang en Subash Dhunghana, voor hulp bij de verzorging van de dieren. Deze publicatie werd mogelijk gemaakt door een institutionele Development Award (idee) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Grant # 2P20GM103432.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
Riferimenti
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol’s iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. . A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O’Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
