Толуидиновый синий, окрашивание смолы встроенные разделы для оценки морфологии периферической нерв
Summary
Здесь мы представляем протокол для визуализации тонких структур периферических нервов, получения и окрашивания 1-2 мкм секции с толуидиновый синий
Abstract
По всему телу, иннервирующих тканях-мишенях с мотором или сенсорные аксоны продлить периферических нервов. Из-за широкого распространения периферических нервов часто повреждены из-за травмы или болезни. Как оценить повреждения периферических нервов в моделях животных, функции и регенерации, были разработаны методы и стратегии анализа морфометрия периферических нервов стала важнейших терминалов результат измерения. Толуидиновый синий, окрашивание нерва крест секций, полученные из смолы встроенных разделов нерва — воспроизводимый метод для качественной и количественной оценки периферических нервов, позволяя визуализации морфологии количество аксонов и степени миелинизации. Этот метод, как и в случае многих других гистологических методов, может быть трудно учиться и мастер, с помощью стандартных письменных протоколов. Поэтому цель данного издания – подчеркнет письменные протоколы для толуидиновый синий, окрашивание периферических нервов с видеосъемка метода, с помощью седалищного нервов заготавливаемым от крыс. В этом протоколе, мы опишем в естественных условиях фиксации периферических нервов и коллекции ткани, и после фиксации с 2% осмия тетраоксид, встраивание нервов в эпоксидной смолы и ultramicrotome секционирование нервов до толщины 1-2μm. Нерва разделы затем передан на стеклянное скольжение и витражи с толуидиновый синий, после чего они количественно и качественно оцениваются. Приведены примеры наиболее распространенных проблем, а также шаги для смягчения этих проблем.
Introduction
Периферические нервы распространяется по всему телу, иннервирующих тканях-мишенях с мотором или сенсорные аксоны1. Периферические нервные дефекты, вызванные медицинских расстройств и травм являются проблемой общественного здравоохранения и имеют большие экономические последствия2,3. Несмотря на успехи в оценке результатов повреждений периферических нервов и пониманию регенерации нервных традиционные методы, такие как нерв гистологии и пятная методы являются важнейшими инструментами качественно и количественно оценить нерва здоровье как терминал результатов измерения в животных моделях или подакцизным тканей человека. Это часто в паре с электрофизиологические измерения функции периферических нервов, где морфометрия может раскрыть почему функциональных нервных регенерации сделал или не происходит.
Толуидиновый синий окрашивание участков смолы встроенных полутонкая периферических нервов — это специальный метод для визуализации Миелинизированные нервные волокна, обеспечивая высокое качество и четкие подробные изображения нервных структур4,5,6 . Толуидиновый синий ацидофильной МЕТАХРОМАТИЧЕСКАЯ пятно, обнаруженный Уильям Перкин в 1856 году7и был использован в нескольких медицинских приложений8. Толуидиновый синий окрашенных периферических нервов секции полученных от смолы встроенный нерв сегментов позволяет четкие визуализации нервных структур. Визуализация Миелиновые оболочки структуры можно повысить путем использования осмия тетраоксид после фиксации4,9. Осмия тетраоксид — токсичных окислителя и липидов фиксирующие агент, который взаимодействует с двойными связями в липидах, что приводит к совершенно определенный липид богатые миелина влагалищ10. Однако осмия тетраоксид токсичных, дорогие, требует больше инкубации нерв сегментов и не всегда используется.
Альтернативные методы обработки и окраски были разработаны для визуализации периферического нерва морфологии; Парафин, криогенные секционирование и эпоксидной смолы встроенный нерва секционирование следуют окрашивание с толуидиновый синий или фенилендиамином решения была использована для количественного определения морфологические изменения периферического нерва регенерации 11,12 . Эти методы имеют свои преимущества и урожайность основных данных о количестве аксоны, толщина миелина, аксон диаметр и аксон диаметром до Миелинизированные волокна диаметром (g коэффициент) 11,13,14,15 .
Основной различие смолы-вложения в этот протокол является, что облегчает получение 1-2 мкм толщина сечения из-за твердости смолы при сохранении гистологические качеств нерва. Эти тонкие, в отличие от 4-5 мкм толщина секций, полученные из парафина встраивание, разделах периферических нервов разделы с более высоким разрешением, позволяющие более точную количественную оценку миелинизации аксона, таких как g коэффициент, который не может быть полученные от толще разделы16. Хотя криогенных секционирование может использоваться для получения разделы 1-2 мкм, это был наш опыт, что это более трудно получить секции без многочисленных крупных трещин. Такие трещины секций может привести к неточной подсчитывая количество аксонов и аспекты миелинизации.
Помимо окрашивания17толуидиновый синий серебряный пятнать метод18 и Массон trichrome окрашивание4 может использоваться также показать нервные аксоны. Однако с помощью смолы встраивание крыса срединного нерва секций витражи с гематоксилином и эозином или Массон в trichrome показал слабый миелиновой оболочки и непризнанных структуры, тогда как окрашивание толуидиновый синий показал ясно Миелиновые оболочки изображения и легко может быть количественных4. Несмотря на некоторые ограничения толуидиновый синий окраски смолы встроенные периферийные нервы это ценный метод, который может использоваться при необходимости изображения с высоким разрешением нерва морфологии.
Основным недостатком для встраивания смола является что это занимает много времени и не позволяет иммуноокрашивания же ткани из-за сложности антигена поиска по сравнению с парафином и замороженных встроенные разделы методов. Таким образом это не возможно использовать же ткани для иммуноокрашивания, который обрабатывается через встраивание смолы для окрашивания толуидиновый синий. Хотя не используется здесь, по желанию иммуногистохимия смолы встроенные разделы, использование гликоля метакрилата, встраивание смолы позволяет для иммуногистохимии выполняется на разделах ткани, но она является относительно дорогим19. Это могут быть несколько смягчены путем разрезания периферических нервов на отдельные сегменты, некоторые для встраивания смолы и другие для иммуноокрашивания сразу после фиксации.
Процесс окрашивания толуидиновый синий смолы встроенных периферических нервов, как с наиболее гистопатологические анализа, могут быть разбиты на пять этапов, включая фиксацию, обезвоживание, встраивание, секционирование и пятнать20. Здесь мы стремимся предоставить протокол и практического руководства для использования смолы окрашенных встраиваемых крыса седалищного нерва разделы с толуидиновый синий получить высокое качество изображения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экзаменов морфологических структур, травмы периферических нервов и регенерации являются частые темы исследования13. В этом протоколе мы описывают шаги для получения высокого качества изображений для количественной гистологических данных с использованием крыса седалищн…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы thankthe Дженкинс микроскопии объекта в университете штата Вайоминг за их помощь и бушменов лаборатории, Келли Roballo, Хайден True, Wupu Osimanjiang и членов Субаш Dhunghana, для помощи в ухода за животными. Это издание стало возможным благодаря институционального развития Award (IDeA) от национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под Грант # 2P20GM103432.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
Riferimenti
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol’s iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. . A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O’Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
