Azul de toluidina mancha de resina-incorporado seções para avaliação da morfologia do nervo periférico
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para visualizar belas estruturas de nervos periféricos obtendo e seções de 1-2 µm com toluidina a coloração azul
Abstract
Nervos periféricos se estendem por todo o corpo, que inervam tecidos-alvo com axônios motor ou sensoriais. Devido à ampla distribuição, nervos periféricos são frequentemente danificados devido a trauma ou doença. Como métodos e estratégias foram desenvolvidas para avaliar lesão de nervo periférico em modelos animais, função e regeneração, analisando a morfometria do nervo periférico tornou-se uma medida de resultado terminal essencial. Seções de toluidina azul coloração do nervo Cruz obtidas de seções de nervo resina incorporada é um método reprodutível para avaliações qualitativas e quantitativas dos nervos periféricos, permitindo a visualização do número de morfologia de axônios e grau de mielinização. Esta técnica, tal como acontece com muitos outros métodos histológicos, pode ser difícil de aprender e dominar usando protocolos padrão de escrita. A intenção desta publicação é, portanto acentuar a protocolos escritos para toluidina azul coloração de nervos periféricos com Videografia do método, usando os nervos ciático de ratos colhidos. Neste protocolo, descrevemos na vivo fixação de nervo periférico e coleta do tecido e pós-fixação com 2% de tetróxido de ósmio, incorporação de nervos em resina epóxi e ultramicrotome de seccionamento dos nervos a espessura de 1-2μm. Seções do nervo, em seguida, transferido para uma lâmina de vidro e corados com azul de toluidina, após o qual são quantitativamente e qualitativamente avaliados. São mostrados exemplos dos problemas mais comuns, bem como medidas para atenuar esses problemas.
Introduction
Nervos periféricos se estendem por todo o corpo, que inervam tecidos-alvo com axônios sensoriais ou motor1. Nervo periférico defeitos causados por doenças e trauma representam uma preocupação de saúde pública e tem grandes impactos econômicos2,3. Apesar dos progressos em avaliar os resultados de lesões nervosas periféricas e entendendo a regeneração do nervo, métodos tradicionais como nervo histologia e técnicas de coloração são ferramentas essenciais para qualitativa e quantitativamente avaliar saúde do nervo como uma medida de resultado terminal em modelos animais ou tecidos humanos extirpado. Isto frequentemente é emparelhado com medições eletrofisiológicas da função do nervo periférico, onde a morfometria pode revelar por regeneração nervosa funcional fez ou não ocorreu.
Azul de toluidina a coloração das seções de nervo periférico semi fina de resina incorporada é um método especializado para as fibras nervosas mielinizadas, proporcionando alta qualidade de imagem e claro imagens detalhadas de nervo estruturas4,5,6 . Azul de toluidina é uma mancha metachromatic acidófilo, descoberta por William Henry Perkin em 1856,7e tem sido utilizada em várias aplicações médicas8. Seções de nervo periférico manchadas de azul de toluidina obtidas de segmentos nervosos resina-incorporado permite a clara visualização das estruturas nervosas. Visualização da bainha de mielina estrutura pode ser reforçada pelo uso de tetróxido de ósmio pós-fixação4,9. Tetróxido de ósmio é um oxidante e lipídios fixador agente tóxico que interage com as ligações duplas em lipídios, resultando em bainhas de mielina rica em lipídios starkly definidos10. No entanto, tetróxido de ósmio é tóxico, caro, exige uma maior incubação de segmentos nervosos e não é sempre usado.
Métodos alternativos de processamento e coloração foram desenvolvidos para visualização da morfologia do nervo periférico; Parafina, criogênico de corte e seccionamento de nervo incorporado de resina epóxi seguiram de coloração com azul de toluidina ou fenilenodiamina solução tem sido usada para quantificar as alterações morfológicas da regeneração de nervo periférico 11,12 . Esses métodos têm suas vantagens e rendimento dados essenciais sobre o número de axônios, espessura da mielina, diâmetro do axônio e diâmetro do axônio para fibras mielinizadas diâmetro (g-ratio) 11,13,14,15 .
A principal distinção de resina-incorporação neste protocolo é que facilita a obtenção de secções de espessura 1-2 μm devido a dureza da resina, mantendo as qualidades histológicas do nervo. Estas seções finas, em oposição as 4-5 μm seções de espessura obtidas de parafina de incorporação, fornecem seções de nervo periférico com maior resolução, permitindo uma quantificação mais precisa de mielinização axônio, tais como o g-relação, que não pode ser Obtido a partir de secções mais espessas16. Enquanto criogênico de corte pode ser usado para obter seções de 1-2 µm, tem sido nossa experiência que é mais difícil obter seções sem numerosas fissuras grandes. Tais seções rachadas podem causar impreciso contagem do número de axônios e aspectos da mielinização.
Além do azul de toluidina coloração17, uma prata coloração método18 e de coloração tricromo de Masson4 também pode ser usada para mostrar os axônios do nervo. No entanto, usar resina incorporação das seções do nervo mediano de rato corados com hematoxilina e eosina ou de Masson tricromo mostrou fracas bainhas de mielina e estruturas não reconhecidas, Considerando que a coloração azul de toluidina mostrou imagem clara da bainha de mielina e pode facilmente ser quantificados4. Apesar de algumas limitações, nervos de toluidina azul coloração de resina incorporada periférica é uma valiosa técnica que pode ser usada quando as imagens de alta resolução da morfologia do nervo são necessárias.
A principal desvantagem para a incorporação de resina é que é demorado e não permite a imunocoloração do mesmo tecido devido à dificuldade de recuperação do antígeno quando comparado com parafina e congelados incorporado seções técnicas. Assim, não é geralmente possível utilizar o mesmo tecido para immunostaining é processado através de incorporação de resina para coloração de azul de toluidina. Embora não usado aqui, se é desejado a imuno-histoquímica em resina seções incorporadas, a utilização de resinas de incorporação de metacrilato de glicol permite imuno-histoquímica ser executada em cortes de tecido, mas é relativamente caro19. Isto pode ser um pouco atenuado pelo corte do nervo periférico em segmentos separados, alguns para a incorporação de resina e outros por imunocoloração diretamente após a fixação.
O processo de coloração de azul de toluidina de resina incorporado os nervos periféricos, como com análise histopatológica mais, pode ser dividido em cinco etapas, incluindo fixação, desidratação, incorporação, corte e coloração20. Pretendemos fornecer um protocolo e orientação prática para usar resina seções do nervo ciático de rato incorporado com imagens de alta qualidade de toluidina azul para adquirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Exames das estruturas morfológicas da lesão de nervo periférico e regeneração são temas frequentes de estudo13. Este protocolo, descreveremos os passos para obter imagens de alta qualidade para quantificações dados histológicos utilizando tecido de nervo ciático rato incorporado em blocos de resina e corados com azul de toluidina. Esta técnica fornece uma imagem da morfologia do nervo em que a regeneração do nervo pode ser quantificada através da medição do número de axônios, gra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria fizeram instalações de microscopia Jenkins na Universidade de Wyoming para a ajuda deles e os membros do laboratório Bushman, Kelly Roballo, Hayden True, Wupu Osimanjiang e Dhunghana eleomar, para assistência em cuidados com animais. Esta publicação foi tornada possível através de um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob Grant # 2P20GM103432.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
Riferimenti
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