Toluidin blå farvning af harpiks-integreret afsnit for evaluering af perifere Nerve morfologi
Summary
Her præsenterer vi en protokol for at visualisere fine strukturer af perifere nerver ved at opnå og farvning 1-2 µm sektioner med toluidin blå
Abstract
Perifere nerver udvide i hele kroppen, innerverer målvæv med motoriske eller sensoriske axoner. På grund af udbredt distribution, er perifere nerver ofte skadet på grund af traumer eller sygdom. Som metoder og strategier er udviklet til at vurdere perifer nerveskade i dyremodeller, funktion og regenerering, er analysere morfometri af perifere nerve blevet en afgørende terminal resultat måling. Toluidin blå farvning af nerve cross dele fremstillet af harpiks indlejret nerve sektioner er en reproducerbar metode til kvalitative og kvantitative vurderinger af perifere nerver, gør det muligt for visualisering af morfologi antallet af axoner og graden af myelination. Denne teknik, kan som med mange andre histologiske metoder, være svært at lære og mestre ved hjælp af standard skriftlige protokoller. Hensigten med denne publikation er derfor at fremhæve skriftlige protokoller for toluidin blå farvning af perifere nerver med videography af den metode, ved hjælp af ischiadicus nerver høstet fra rotter. I denne protokol, vi beskriver i vivo perifere nerve fiksering og samling af væv, og efter fiksering med 2% osmium dinitrogentetraoxid, integrering af nerver i epoxy-harpiks, og ultramicrotome skæring af nerver til 1-2μm tykkelse. Nerve sektioner derefter overført til et glas dias og farves med toluidin blå, hvorefter de kvantitativt og kvalitativt vurderes. Eksempler på de mest almindelige problemer er vist, samt trin for at afhjælpe disse problemer.
Introduction
Perifere nerver udvide i hele kroppen, innerverer målvæv med motoriske eller sensoriske axoner1. Perifere nerve defekter forårsaget af medicinske lidelser og traumer repræsenterer et alvorligt folkesundhedsproblem og har store økonomiske konsekvenser2,3. Trods fremskridt i vurderingen af resultaterne af perifere nerve skader og forståelse nerve regenerering, er traditionelle metoder såsom nerve histologi og farvning teknikker væsentlige værktøjer til kvalitativt og kvantitativt vurdere nerve sundhed som en terminal resultat måling i dyremodeller eller skåret humant væv. Dette er ofte parret med elektrofysiologiske målinger af perifere nervefunktion, hvor morfometri kan afsløre hvorfor funktionelle nerve regenerering gjorde eller ikke opstår.
Toluidin blå farvning af harpiks integreret semi-tynd perifere nerve sektioner er en specialiseret metode til imaging myelinerede nervefibre, at levere høj kvalitet og klare detaljerede billeder af nerve strukturer4,5,6 . Toluidin blå er en acidophilic metakromatisk pletten, opdaget af William Henry Perkin i 18567, og har været anvendt i flere medicinske anvendelser8. Toluidin blå-farvede perifere nerve dele fremstillet af harpiks-embedded nerve segmenter giver mulighed for klart visualisering af nerve strukturer. Visualisering af myelinskeden struktur kan forbedres ved brug af osmium dinitrogentetraoxid efter fiksering4,9. Osmium dinitrogentetraoxid er en giftig oxidant og lipid Fikseringsvæske agent, der interagerer med dobbeltbindinger i lipider, hvilket resulterer i skarp definerede lipid-rige myelin skeder10. Men osmium dinitrogentetraoxid er giftige, dyre, kræver en længere inkubation af nerve segmenter, og bruges ikke altid.
Alternative metoder til forarbejdning og farvning er blevet udviklet til visualisering af perifere nerve morfologi; Paraffin, kryogene skæring og epoxy harpiks-embedded nerve skæring efterfulgt af farvning med toluidin blå eller phenylendiamin løsning er blevet brugt til at kvantificere morfologiske ændringer af perifer nerve regenerering 11,12 . Disse metoder har deres fordele og udbytte vigtige data om antallet af axoner, myelin tykkelse, axon diameter og axon diameter til myelinerede fiber diameter (g-ratio) 11,13,14,15 .
Den primære forskel af harpiks-indlejring i denne protokol er, at det letter at få 1-2 μm tykkelse tværsnit på grund af hårdhed af harpiks samtidig opretholde de histologiske kvaliteter af nerve. Disse tynde sektioner, i stedet for de 4-5 μm tykkelse dele fremstillet af paraffin indlejring, give perifer nerve sektioner med højere opløsning, giver mulighed for en mere nøjagtig kvantificering af axon myelination, som g-ratio, der ikke kan fremstillet af tykkere afsnit16. Mens kryogene skæring kan bruges til at få 1-2 µm sektioner, har det været vores oplevelse, at det er mere vanskeligt at opnå sektioner uden talrige store revner. Sådanne halvtosset sektioner kan medføre unøjagtige optælling af antallet af axoner og aspekter af myelination.
Ud over toluidin blå farvning17, kan en sølvfarvning metode18 og Masson’s trichrome farvning4 også bruges til at vise nerve axoner. Men ved hjælp af harpiks indlejring af rotte median nerve sektioner farves med enten hæmatoxylin og eosin eller Masson’s trichrome viste svage myelin skeder og ukendt strukturer, mens toluidin blå farvning viste klart myelinskeden billede og let kan være kvantificeret4. Trods nogle begrænsninger, toluidin blå farvning af harpiks indlejret perifere nerver er en værdifuld teknik, der kan bruges, når billeder i høj opløsning af nerve morfologi er påkrævet.
Den primære ulempe for harpiks indlejring er at det er tidskrævende og ikke tillader immunfarvning af de samme væv på grund af vanskeligheden ved antigen hentning i forhold til paraffin og frosne integrerede sektioner teknikker. Således er det ikke generelt muligt at udnytte den samme væv til immunfarvning, der er behandlet via harpiks-indlejring for toluidin blå farvning. Selv om ikke anvendes her, hvis Immunhistokemi ønskes i harpiks integrerede dele, brug af glycol methacrylat indlejring harpiks giver mulighed for Immunhistokemi skal udføres på væv sektioner, men det er relativt dyrt19. Dette kan afbødes lidt ved at skære den perifere nerve i adskilte segmenter, nogle til integrering af resin og andre for immunfarvning direkte efter fiksering.
Processen med toluidin blå farvning af harpiks indlejret perifere nerver, som med de fleste histopatologiske analyse, kan blive brudt op i fem faser, herunder fiksering, dehydrering, indlejring, skæring og farvning20. Vores mål her at give en protokol og praktiske retningslinjer for brug af harpiks integrerede rotte iskiasnerven sektioner farves med toluidin blå at erhverve høj kvalitetsbilleder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Undersøgelser af de morfologiske strukturer af perifer nerveskade og regenerering er hyppige emner af undersøgelsen13. I denne protokol beskrive vi trin for at opnå høj kvalitetsbilleder for histologiske kvantificeringer ved hjælp af rotte iskiasnerven væv indkapslet i harpiks blokke og farves med toluidin blå. Denne teknik giver et billede af nerve morfologi, hvor nerve regenerering kan kvantificeres ved at måle antallet af axoner, myelination, tilstedeværelse af infiltrativ fibrotisk v?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne thankthe Jenkins mikroskopi facilitet på Wyoming Universitet for deres hjælp, og medlemmerne af Bushman lab, Kelly Roballo, Hayden sande, Wupu Osimanjiang og aske Dhunghana, om bistand til pasning af dyr. Denne publikation blev gjort mulig ved en institutionel udvikling Award (idé) fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Grant # 2P20GM103432.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
Riferimenti
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol’s iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. . A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O’Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
