Toluidine blå flekker av harpiks-Embedded seksjoner for evaluering av eksterne Nerve morfologi

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å visualisere fine strukturer av eksterne nerver av å skaffe og flekker 1-2 µm seksjoner med toluidine blå

Abstract

Eksterne nerver utvide i hele kroppen, innervating målet vev med motor eller sensoriske axons. På grunn av alminnelig utbredt distribusjon, er perifere nerver ofte skadet på grunn av traumer eller sykdom. Som metoder og strategier har blitt utviklet for å vurdere eksterne nerve skade i dyremodeller, funksjon og gjenfødelse, er analysere morphometry av eksterne nerve blitt en viktig terminal utfallet måling. Toluidine blå flekker av nerve tvers deler fra harpiks innebygd nerve deler er en reproduserbar metode for kvalitativ og kvantitativ vurderinger av eksterne nerver, aktivere visualisering morfologi antall axons og grad av myelination. Denne teknikken, kan som med mange andre histologiske metoder, være vanskelig å lære og mestre bruker skriftlig standardprotokoller. Hensikten med denne publikasjonen er derfor å fremheve skriftlig protokoller for toluidine blå flekker av eksterne nerver med videography av metoden bruker sciatic nerver høstet fra rotter. I denne protokollen, beskriver vi i vivo perifere nerve fiksering og samling av vev og etter fiksering med 2% osmium tetroxide, innebygging av nerver i epoxy harpiks og ultramicrotome snitting av nerver til 1-2μm tykkelse. Nerve deler deretter overført til et glass lysbilde og farget med toluidine blå, etter som de kvalitativt og kvantitativt vurderes. Eksempler på de vanligste problemene vises, og fremgangsmåten for begrensende disse problemene.

Introduction

Eksterne nerver utvide i hele kroppen, innervating målet vev med motor eller sensoriske axons¹. Eksterne nerve feil forårsaket av medisinske lidelser og traumer representerer en stor offentlig helse bekymring og har store økonomiske virkninger^2,3. Til tross for fremskritt i vurdere resultatene av eksterne nerve skader og forstå nerven fornyelse, er tradisjonelle metoder som nerve histologi og flekker teknikker viktige verktøy å kvalitativt og kvantitativt vurdere nerve helse som en terminal utfallet måling i dyremodeller eller forbrukeravgift menneskelig vev. Dette er ofte kombinert med elektrofysiologiske målinger av eksterne nerve funksjon, hvor morphometry kan avsløre hvorfor funksjonelle nerven fornyelse gjorde ikke eller.

Toluidine blå flekker av harpiks innebygd semi tynn perifere nerve er en spesialisert metode for imaging myelinated nerve fibre, gir høy kvalitet og fjern detaljerte bilder av nerve strukturer^4,5,6 . Toluidine blå er en syre metachromatic flekken, oppdaget av William Henry Perkin i 1856⁷, og har blitt brukt i flere medisinske anvendelser⁸. Toluidine blå-farget perifere nerve deler fra harpiks-embedded nerve segmenter kan tydelig visualisering av nerve strukturer. Visualisering av myelin-skjeden strukturen kan styrkes ved bruk av osmium tetroxide etter fiksering^4,9. Osmium tetroxide er en giftig oksiderende og lipid etappe, den stabiliserende agent som samhandler med dobbel bindingene i lipider, noe som resulterer i tydelig definerte lipid-rik myelin sheaths¹⁰. Imidlertid osmium tetroxide er giftige, dyr, krever en lengre inkubasjonstiden for nerve segmenter, og brukes ikke alltid.

Alternative metoder for behandling og flekker har blitt utviklet for visualisering av eksterne nerve morfologi; Parafin, kryogene snitting og epoxy harpiks-embedded nerve snitting etterfulgt av flekker med toluidine blå eller phenylenediamine brukes å kvantifisere morfologiske endringer av eksterne nerven fornyelse ^11,12 . Disse metodene har sine fordeler og gir viktige data på antall axons, myelin tykkelse, diameter axon og axon diameter myelinated fiber diameter (g-forholdet) ^11,13,14,15 .

Primære æren av harpiks-innebygging i denne protokollen er at det muliggjør å få 1-2 μm tykkelse tverrsnitt på grunn av harpiks hårde samtidig opprettholde histologiske kvaliteter av nerve. Disse tynne snitt, i motsetning til de 4-5 μm tykkelse delene fra parafin embedding, gi eksterne nerve seksjoner med høyere oppløsning, noe som åpner for en mer nøyaktig kvantifisering av axon myelination, for eksempel g-forholdet, som ikke kan Hentet fra tykkere deler¹⁶. Mens kryogene snitting kan brukes til å få 1-2 µm deler, er det vår erfaring at det er vanskeligere å få avsnitt uten mange store sprekker. Slike sprakk inndelinger kan føre til unøyaktige telling av antall axons og aspekter av myelination.

I tillegg til toluidine blå flekker¹⁷, kan sølv flekker metoden¹⁸ og Masson’s trichrome flekker⁴ også brukes til å vise nerve axons. Men farget ved hjelp av harpiks innebygging av rotte median nerve deler med enten hematoxylin eosin eller Masson’s trichrome viste svak myelin hylser og ukjent strukturer, mens toluidine blå flekker viste klart myelin-skjeden bilde og enkelt kan være kvantifisert⁴. Til tross for noen begrensninger, toluidine blå flekker av harpiks innebygd ekstern nerver er en verdifull teknikk som kan brukes når bilder med høy oppløsning av nerve morfologi.

Den eneste ulempen for harpiks innebygging er at det er tidkrevende og ikke tillater immunostaining av samme vev på grunn av vanskelighetene med antigen henting i forhold til parafinsnitt og frosne innebygde deler teknikker. Dermed er det ikke vanligvis mulig å benytte samme vev for immunostaining som behandles via harpiks-innebygging av toluidine blå flekker. Selv om ikke brukt her, hvis immunohistochemistry i harpiks innebygde deler, bruk av glykol methacrylate innebygging harpikser tillater immunohistochemistry utføres på vev deler, men det er relativt dyre¹⁹. Dette kan reduseres noe ved å kutte perifere nerve i separate segmenter, noen for innebygging av harpiks og andre for immunostaining rett etter fiksering.

Prosessen med toluidine blå flekker av harpiks innebygd ekstern nerver, som med de fleste histopathological analyse, kan bli delt opp i fem stadier, inkludert fiksering, dehydrering, innebygging, skjæring og flekker²⁰. Vi ønsker her å gi en protokoll og praktiske retningslinjer for bruk av harpiks innebygde rotte ischias nerven deler farget med toluidine blå å kjøpe høy kvalitet bilder.

Protocol

Voksen Sprague Dawley rotter ble brukt i dette prosjektet og alle prosedyrer ble godkjent av University of Wyoming institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen. 1. kirurgi og i Vivo Nerve fiksering Merk: Leverandørinformasjon for alle materialer og utstyr som brukes i denne protokollen er oppført i Tabellen for materiale. Merk: I vivo nerve fiksering brukes å bevare vevet og redusere strukturelle fornedr…

Representative Results

Harpiks innebygd ekstern nerve deler farget med toluidine blå tillate nøyaktige histologiske data quantifications. En oversikt over fremgangsmåten vises i (figur 2). Sciatic nerver seksjoner innebygd i harpiks medium og farget med toluidine blå viste klare bilder med optimal oppløsning (tall 3). Nerveskader kan forårsake mange endringer i nerve morfologiske strukturer, for eksempel endringer i nerve fiber og axon diameter myelin-skjeden…

Discussion

Undersøkelser av morfologiske strukturer av eksterne nerve skader og gjenfødelse er hyppige fag studie¹³. I denne protokollen beskriver vi fremgangsmåten for å få høy kvalitet bilder for histologiske dataene quantifications ved hjelp av rotte sciatic nervevev innebygd i harpiks blokker og farget med toluidine blå. Denne teknikken gir et bilde av nerve morfologi der nerven fornyelse kan kvantifiseres ved å måle antall axons, myelination, tilstedeværelse av infiltrasjon fibrotiske vev og h…

Materials

Dulbecco's Phosphate Buffer Saline	Gibco	14200-075
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate	Acros Organics	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit	Sigma-Aldrich	45359
Sodium Hydroxide Solution	Sigma-Aldrich	72068	To adjust Trump's fixative pH
Acetone	Fisher Chemical	170942
Osmium Tetroxide Solution	Sigma-Aldrich	75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12545102
Pelco Embedding Cast	Fisher Scientific	NC9671811
Glass Knife Maker	RMC Products	GKM-2
Ultramicrotome	RMC Products	MT-XL
15 mL Conical Tube	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661
4 mL Glass Vial	Sigma-Aldrich	854190
Razor Blades	VWR	55411-050	For trimming resin block
Perfect Loop	Electron Microscopy Sciences	70944	For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm	Electron Microscopy Sciences	71012
100 Watt Oven	Millipore	6350115
Whatman Filter Paper	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL plastic pipette	Sigma-Aldrich	Z331740
Micro-surgical Kit	World precision instruments
Olympus fluorescence microscope			Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80