Axée sur la plaque de culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans: préparation des échantillons pour l’étude des modifications métaboliques dans le diabète
Summary
Ce protocole décrit une méthode pour la culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans , sur des milieux solides. Comme alternative à la culture liquide, ce protocole permet d’obtenir les paramètres de différentes échelles en culture axée sur la plaque. Cela augmente la comparabilité des résultats en omettant les différences morphologiques et métaboliques entre culture des médias liquides et solides.
Abstract
Cultivant Caenorhabditis elegans (c. elegans) de façon à grande échelle sur des plaques de gélose peut être long et difficile. Ce protocole décrit une méthode simple et peu coûteuse pour obtenir un grand nombre d’animaux pour l’isolement des protéines de procéder à de nouvelles analyses protéomique, spectrométrie de masse ou une tache occidentale. Par ailleurs, une augmentation de nombre de nématodes pour immunostainings et l’intégration des analyses multiples dans les mêmes conditions de culture peuvent être facilement réalisées. En outre, un transfert entre plaques avec différentes conditions expérimentales est facilité. Les techniques courantes dans la culture de la plaque à la cession d’un seul c. elegans en utilisant un fil de platine et le transfert de gélose peuplée en morceaux à l’aide d’un scalpel. Cependant, avec l’augmentation du nombre de nématodes, ces techniques deviennent trop longues. Ce protocole décrit la culture à grande échelle c. elegans incluant de nombreuses mesures pour minimiser l’impact de la préparation de l’échantillon sur la physiologie du ver. Fluide et contrainte de cisaillement peuvent modifier la durée de vie et les processus métaboliques chez c. elegans, ce qui nécessite une description détaillée des étapes critiques afin de récupérer des résultats fiables et reproductibles. C. elegans est un organisme modèle, consistant en des cellules neuronales jusqu’à un tiers, mais n’ayant pas de vaisseaux sanguins, permettant ainsi la possibilité d’étudier uniquement des altérations neuronales indépendantes contrôle vasculaire. Récemment, début neurodégénérescence dans la rétinopathie diabétique a été trouvé avant des altérations vasculaires. Ainsi, c. elegans est d’un intérêt particulier pour l’étude des mécanismes généraux des complications du diabète. Par exemple, une formation accrue d’advanced glycation produits (Age) et les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont observée, que l’on retrouve de façon reproductible chez c. elegans. Protocoles pour gérer les échantillons de taille suffisante pour un plus large éventail d’enquêtes sont présentées ici, illustré par l’étude des altérations biochimiques induites par le diabète. En général, le présent protocole peut être utile pour les études nécessitant une grande c. elegans numéros et dans quelle culture liquide ne convient pas.
Introduction
Les analyses de protéines, comme une tache occidentale ou la spectrométrie de masse, nécessitent milligrammes de protéines. Ce rendement nécessite une culture à grande échelle de centaines c. elegans, qui peut être accompli par la culture liquide ou sur des milieux solides, transférant les nématodes par lavage. Fluide et contrainte de cisaillement induit l’expression des canaux sodium épithélial (ENaC), ce qui pourrait augmenter le stress osmotique à travers une augmentation de l’absorption de sodium, potentiellement modifier la durée de vie de c. elegans et affectant les analyses métaboliques1 . Par conséquent, certaines étapes critiques dans le présent protocole pour l’approche axée sur la plaque prennent la réduction du stress affectant la variabilité expérimentale en compte. Milieu de culture liquide, d’autre part, influe sur le phénotype des nématodes et complique la culture et la collection d’un nombre exact de nématodes2. En outre, substances réactives peuvent être modifiés par les composants de médias et peuvent distribuer inégalement avant d’atteindre les nématodes. Relatives aux limitations de culture liquide, ce protocole prévoit une approche alternative à la culture des échantillons à grande échelle de c. elegans.
C. elegans est un organisme modèle avec un réseau distinct de 302 neurones, qui constituent un tiers de toutes ses cellules3. Depuis son introduction dans la science, bon nombre d’homologues et gènes orthologues ont été décrites, amplifiant sa valeur comme un modèle pour la recherche médicale. Récemment, les preuves pour des troubles neurologiques dans la rétinopathie diabétique, précédant les lésions vasculaires, a été présenté4. C. elegans est dépourvu de vaisseaux sanguins, mais contient un réseau neuronal distinct, ce qui en fait un modèle approprié pour enquêter sur des altérations neuronales en dehors vasculaire. Ainsi, c. elegans est d’un intérêt particulier pour l’étude des mécanismes généraux des complications du diabète. Les modifications biochimiques dans les complications du diabète impliquent la formation d’Age, qui influencent davantage la formation de ROS en réponse à l’hyperglycémie5. Sont trouvent chez c. elegans et contribuent aux dommages neuronaux6ans. Les maladies chroniques sont souvent causés par des processus complexes, polygéniques, nécessitant une approche multiparamétrique pour l’évaluation de leurs mécanismes sous-jacents, comme exemplifié ici avec l’évaluation des complications du diabète. Ce protocole peut être utiles pour l’obtention des paramètres multiples simultanément, ainsi que par la suite. Comparabilité accrue et la reproductibilité d’une approche multiparamétrique est possible en omettant les différences morphologiques et métaboliques entre culture des médias liquides et solides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole présente une approche fiable pour la culture à grande échelle c. elegans afin d’obtenir des résultats quantitatifs. Les résultats de la littérature pourraient être transposés comme indiqué dans les Résultats de représentant. Même si ce protocole pour le prélèvement d’échantillons à grande échelle de c. elegans semble être une méthode directe, il y a certains pièges à prendre en compte. Concernant la synchronisation de la population des nématodes, c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le IRTG 1874 « Complications microvasculaires du diabète » et le CRC 1118 « Métabolites réactifs comme une cause de complications liées au diabète tardive ». Les souches de c. elegans N2 et CL2166 ont été fournis par la CCG, qui est financée par le NIH Office de programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440).
Materials
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
Riferimenti
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