Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama
Summary
Bu iletişim kuralı bir yöntem Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ekimi için katı medyada açıklar. Sıvı kültür alternatif, bu protokol parametreleri farklı ölçeklerde plaka tabanlı ekilen almak sağlanır. Bu sonuçlar karşılaştırılabilir sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak artırır.
Abstract
Ağar kaplamalar üzerinde büyük ölçekli bir şekilde Caenorhabditis elegans (C. elegans) kültür zaman alıcı ve zor olabilir. Bu iletişim kuralı çok sayıda hayvan proteinleri bir western blot, kütle spektrometresi veya daha fazla proteomik analizleri ile devam etmek için yalıtım için elde etmek için basit ve ucuz bir yöntem açıklanır. Ayrıca, immunostainings nematodunun numaralarındaki artış ve aynı kodlamayla koşullar altında birden fazla analizleri entegrasyonu kolayca elde edilebilir. Ayrıca, farklı deneysel koşullar ile plakalar arasında bir transferi kolaylaştırdı. Plaka kültürde yaygın teknikleri bir platin tel kullanarak tek bir C. elegans transferini içerir ve bir neşter kullanarak nüfuslu agar transferini parçalar. Ancak, yuvarlak sayıları artan, bu tekniklerin aşırı zaman alıcı olur. Bu iletişim kuralı solucan numune hazırlama fizyolojisi üzerinde etkisini en aza indirmek için çeşitli adımlar da dahil olmak üzere C. elegans büyük ölçekli kültür açıklar. Sıvı ve yamultma stres ömrü ve böylece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar almak için kritik adımları ayrıntılı bir açıklama gerektiren C. elegans, metabolik süreçleri değiştirebilir. C. elegans bir model organizma ilâ 1 / 3 için nöronal hücre oluşan, ama kan damarları eksik, böylece yalnızca nöronal değişiklikler vasküler kontrolünü bağımsız araştırmaya imkanı sunmaktadır. Son zamanlarda, diabetik retinopati erken ateş vasküler değişiklikler önce bulundu. Böylece, C. elegans diyabetik komplikasyonların genel mekanizmaları eğitim için özel ilgi olmasıdır. Örneğin, artan bir oluşumu glikasyondan son ürünleri (Yaş) gelişmiş ve reaktif oksijen türlerine (ROS) tekrarlanarak C. elegansiçinde bulunan görülmektedir. Örnekleri soruşturmaların daha geniş bir spektrum için yeterli büyüklükte işlemek için iletişim kuralları burada, biyokimyasal değişiklikler diyabet kaynaklı çalışmayla örneği sunulmuştur. Genel olarak, bu protokolü büyük C. elegans gerektiren çalışmalar için yararlı olabilir numaraları ve hangi sıvı kültürü uygun değildir.
Introduction
Protein analizleri, Batı leke veya kütle spektrometresi, gibi protein miligram gerektirir. Bu verim hangi sıvı kültür veya katı medya nematodlar aktarma yıkama tarafından gerçekleştirilebilir C. elegans, yüzlerce bir büyük ölçekli kültür gerektirir. Sıvı ve yamultma stres indükler ozmotik stres ile artan bir potansiyel C. elegans ömrünü değiştirme ve metabolik analizleri1 etkileyen sodyum alımını artırmak olabilir epitel sodyum kanalları (ENaC), ifade . Bu nedenle, bu iletişim kuralı için plaka dayalı yaklaşım bazı kritik adımları dikkate deneysel değişkenlik etkileyen stres azaltma almak. Sıvı kültür, öte yandan, nematodlar fenotip etkiler ve kültür ve Nematodlar2tam bir sayısını topluluğu olmak zordur. Ayrıca, reaktif maddeler ortam bileşenleri tarafından değiştirilebilir ve düzensiz nematodlar ulaşmadan önce dağıtabilirsiniz. Sıvı kültür sınırlamaları ile ilgili, bu iletişim kuralı C. elegansbüyük ölçekli örnekler kültür için alternatif bir yaklaşım sağlar.
C. elegans 302 nöronal hücre, ayrı bir ağ ile bir model organizma üçte biri kadar tüm onun hücreleri3yapıyor. Bilim, birçok homolog içine yana ve orthologous genler tıbbi araştırma için bir model olarak değerini yükseltecek tarif edilmiştir. Son zamanlarda, diyabetik retinopati, vasküler hasar, önceki nörolojik bozukluğu için kanıt4sundu. C. elegans kan damarları eksik, ama farklı nöronal ağ, nöronal değişiklikler vasküler olanlar dışında araştırmak için uygun bir model yapım içerir. Böylece, C. elegans diyabetik komplikasyonların genel mekanizmaları eğitim için özel ilgi olmasıdır. Diyabetik komplikasyonlar içinde biyokimyasal değişiklikler daha fazla hiperglisemi5yanıt ROS oluşumuna etkisi yaş oluşumu dahil. Yaş C. elegans içinde bulunur ve nöronal hasar6için katkıda bulunmak. Kronik hastalıklar genellikle altta yatan mekanizmaları değerlendirmesi için multiparametric bir yaklaşım gerektiren karmaşık, polygenic işlemler tarafından burada diyabetik komplikasyonların değerlendirilmesi ile olarak meydana gelir. Bu iletişim kuralı birden çok parametre aynı anda, hem de daha sonra elde etmek için kullanım olabilir. Artan karşılaştırılabilir ve multiparametric bir yaklaşım tekrarlanabilirlik sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak elde edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı büyük ölçekli sayısal sonuçlar elde etmek için C. elegans kültür için güvenilir bir yaklaşım sunuyor. Literatür bulguları Temsilcisi sonuçlarıgösterildiği gibi çoğaltılmış. Bu iletişim kuralı C. elegans büyük ölçekli örnekler topluluğu için bir düz ileri yöntem gibi görünüyor olsa da, dikkate almak için bazı tuzaklar vardır. Nematodunun nüfus eşitleme ile ilgili, bu iletişim kuralı nematodlar yok ve sadece yumurta hasat s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) IRTG 1874 “Diyabetik mikrovasküler komplikasyonlar” içinde ve CRC 1118 “Reaktif metabolitleri diyabetik geç komplikasyonlar nedeni olarak” tarafından desteklendi. C. elegans suşları N2 ve CL2166 araştırma altyapı programları (P40 OD010440) NIH ofisi tarafından finanse edilen CGC tarafından temin edilmiştir.
Materials
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
Riferimenti
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
