Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

Summary

Este protocolo describe un método para el cultivo a gran escala de Caenorhabditis elegans en medios sólidos. Como alternativa a la cultura líquida, este protocolo permite la obtención de parámetros de diferentes escalas basadas en la placa de cultivo. Esto incrementa la comparabilidad de los resultados, omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.

Abstract

Cultivo de Caenorhabditis elegans (C. elegans) de manera a gran escala en placas de agar puede ser desperdiciador de tiempo y difícil. Este protocolo describe un método sencillo y económico para obtener un gran número de animales para el aislamiento de proteínas para proceder con una mancha blanca /negra occidental, espectrometría de masas o análisis de proteómica más. Además, un aumento del número de nematodos para immunostainings y la integración de múltiples análisis en las mismas condiciones de cultivo pueden fácilmente lograrse. Además, se facilita una transferencia entre placas con diferentes condiciones experimentales. Técnicas comunes en la cultura de la placa implican a la transferencia de un solo C. elegans mediante un alambre de platino y la transferencia de agar poblada trozos con un bisturí. Sin embargo, con el aumento del número de nematodos, estas técnicas se convierten en demasiado tiempo. Este protocolo describe el cultivo a gran escala de C. elegans incluyendo numerosas medidas para minimizar el impacto de la preparación de la muestra sobre la fisiología de la lombriz. Líquido y la tensión de esquileo pueden alterar la duración de los procesos metabólicos en C. elegans, así requiriendo una descripción detallada de los pasos críticos para obtener resultados confiables y reproducibles. C. elegans es un organismo modelo, consistiendo en las células neuronales hasta la tercera, pero carece de vasos sanguíneos, proporcionando así la posibilidad de investigar únicamente neuronales alteraciones independientes de control vascular. Recientemente, neurodegeneración precoz en la retinopatía diabética fue encontrada antes de alteraciones vasculares. Así, C. elegans es de especial interés para el estudio de los mecanismos generales de las complicaciones diabéticas. Por ejemplo, una formación creciente de había avanzada glicación final (edades) y especies reactivas del oxígeno (ROS) se observaron, que se encuentran reproducible en C. elegans. Protocolos para manejar las muestras de tamaño adecuado para un espectro más amplio de investigaciones se presentan aquí, ejemplificado por el estudio de la diabetes inducida por alteraciones bioquímicas. En general, este protocolo puede ser útil para estudios que requieren gran C. elegans números y en que cultivos líquidos no es conveniente.

Introduction

Análisis de proteína, como un western blot o espectrometría de masas, requieren miligramos de proteína. Esta producción requiere de un cultivo a gran escala de cientos de C. elegans, que se pueden lograr cultivos líquidos o en medios sólidos transferencia de los nematodos por lavado. Líquido y la tensión de esquileo induce la expresión de canales de sodio epitelial (ENaC), que puede aumentar el estrés osmótico a través de una mayor absorción de sodio, potencialmente alterar la vida de C. elegans y afectar los análisis metabólicos¹ . Por lo tanto, algunos pasos críticos en este protocolo para el enfoque basado en la placa toman la reducción de estrés que afectan a la variabilidad experimental en cuenta. Cultivo líquido, por otro lado, influye en el fenotipo de los nematodos y complica la cultura y la colección de un número exacto de nematodos². Por otra parte, sustancias reactivas pueden modificarse por los componentes de los medios de comunicación y pueden distribuir irregularmente antes de llegar a los nematodos. Con respecto a las limitaciones de cultivo líquido, este protocolo proporciona un acercamiento alternativo al cultivo de las muestras a gran escala de C. elegans.

C. elegans es un organismo modelo con una red distinta de 302 células neuronales, que constituyen un tercio de sus células³. Desde su introducción en la ciencia, muchos homólogos y orthologous genes se han descrito, amplificando su valor como modelo para la investigación médica. Recientemente, se han presentado pruebas de deterioro neurológico en la retinopatía diabética, anterior a daño vascular,⁴. C. elegans carece de vasos sanguíneos, pero contiene una red neuronal distinta, lo que es un modelo conveniente para investigar alteraciones neuronales además de vascular. Así, C. elegans es de especial interés para el estudio de los mecanismos generales de las complicaciones diabéticas. Alteraciones bioquímicas en las complicaciones diabéticas implican la formación de las edades, que más influyen en la formación de ROS en respuesta a la hiperglucemia⁵. Las edades se encuentran en C. elegans y contribuyen al daño neuronal⁶. Enfermedades crónicas son causadas a menudo por procesos complejo, poligénicos, que requieren un enfoque multiparamétrico para la evaluación de sus mecanismos subyacentes, ejemplificado aquí con la evaluación de las complicaciones diabéticas. Este protocolo puede ser de utilidad para la obtención de múltiples parámetros simultáneamente, así como posteriormente. Se logra mayor comparabilidad y reproducibilidad de un enfoque multiparamétrico omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.

Protocol

Nota: Este protocolo se divide en cinco secciones. En las secciones 1-3, se presenta el protocolo principal de cultura C. elegans en un a gran escala. Las secciones 4 y 5 proporcionan protocolos adicionales para la evaluación de metabolitos ejemplificadas en metabolitos diabéticas. En detalle, sección 1 describe una cultura general a gran escala en las placas. Sección 2 se centra en la transferencia de grandes cantidades de C. elegans, considerando que la sección 3 explica la recolección de una mu…

Representative Results

Aquí ejemplos de creación de una gran escala C. elegans cultura para aplicaciones en la investigación de la diabetes se presentan. Puede ser de interés para relacionarse con los parámetros de un solo animal, en lugar de normalizar la concentración de proteína total. En un análisis que requiere un pequeño número de nematodos, esto puede lograrse fácilmente por conteo de los nematodos. Para un a gran escala C. elegans la cultura que implican cientos de nematodos…

Discussion

Este protocolo presenta un enfoque fiable para el cultivo a gran escala de C. elegans para obtener resultados cuantitativos. Los hallazgos de la literatura podrían repetirse tal como se muestra en los Resultados de representante. Aunque este protocolo para la recogida de muestras a gran escala de C. elegans parece un método sencillo, hay algunos riesgos a tener en cuenta. Con respecto a la sincronización de la población de nematodos, este protocolo describe un acercamiento por blanq…

Materials

E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.