הכנה של תרבות התא העיקרי באיכות גבוהה של דגים Pituitaries
Summary
כאן נתאר פרוטוקול להכין ולשמור על תרביות תאים יותרת המוח הראשי של medaka (Oryzias latipes). תנאי ממוטבת פרוטוקול זה להתחשב פרמטרים חשובים כגון טמפרטורה, osmolality ו- pH מאת לחקות את התנאים הפיזיולוגיים של הדג, ובעקבותיו פיזיולוגית משמעותי יותר תוצאות.
Abstract
התרבות התא העיקרי הוא כלי רב עוצמה בשימוש נפוץ על ידי מדענים לחקור מנגנונים של תאים מבודדים בסביבה מבוקרת ולמאפיינים הסלולר. למרות השוני העצום פיזיולוגי בין יונקים ודגים, התא הראשי תרבות פרוטוקולים דגים מבוססים לעתים קרובות על תנאים בתרבית של תרבות, לעיתים קרובות עם שינויים מזעריים בלבד. ההבדלים סביבתיים משפיעים על טמפרטורת הגוף אלא גם נסיוב הדם פרמטרים כגון osmolality, ה-pH pH מאגר קיבולת. תא תרבות המדיה ופתרונות עבודה דומה נועדו לחקות את מאפייני נוזל חוץ-תאי ו/או בסרום הדם אשר תא הוא מותאם, זה חיוני כי פרמטרים אלו מותאמות במיוחד כדי בבעל.
בפרוטוקול הנוכחי מתאר תנאים אופטימליים תרבות ראשי medaka (Oryzias latipes). הפרוטוקול מספק שלבים מפורטים כיצד לבודד ולתחזק בריא הפומבית תאים יותרת המוח במשך יותר משבוע, כולל את השלבים הבאים: 1. התאמת osmolality על הערכים שנמצאו פלזמה דם medaka, 2. התאמת בטמפרטורת דגירה לטמפרטורת medaka רגיל (כאן במתקן aquarium), ו-3. ההתאמה של מאגר ה-pH של ביקרבונט לערכים להשוות מינים אחרים של דגים חיים בטמפרטורה דומה. התוצאות שהוצגו באמצעות פרוטוקול המתואר לקדם תוצאות משמעותיות מבחינה פיזיולוגית medaka, יכול לשמש כמדריך הפניה על ידי מדענים ביצוע תרביות תאים ראשי ממינים אחרים שאינם מידע יונקים.
Introduction
תרבית תאים הוא אחד הכלים המרכזיים המשמשים למחקר ביולוגי מולקולרי, מספקת מערכת דגם מעולה עונה על שאלות ביולוגיות שונות ועד פיסיולוגיה תאית נורמלי סמים ההקרנה, carcinogenesis1. ראשי תאים, מבודד ישירות מן הרקמה החיה בשיטות אנזימטי ו/או מכני, לעיתים קרובות נחשבים יותר ביולוגית רלוונטית יותר שורות תאים כמו התגובה הביולוגי עשוי להיות קרוב יותר למצב ויוו . צריך להיות מוטבת פרוטוקולים עבור הכנת תרביות תאים הראשי עבור כל סוג מינים ותא של הריבית על מנת לחקות את המאפיינים אשר תא הוא מותאם, להשיג תוצאות משמעותיות מבחינה פיזיולוגית.
פרוטוקולים רבים מתארים תרבות התנאים עבור מערכות בתרבית של תאים, בעוד פרוטוקולים דומה המתארים התרבות העיקרית תנאים תאי דגים נדירים למדי בהשוואה. התאים הם פגיעים השינויים המהירים טמפרטורה, pH ו osmolality ולאחר חלשים במיוחד במהלך ההליך דיסוציאציה. פתרונות מלח מסחרי ומדיה תרבות המשמש בתרבית של תאים מהונדסים אינן מיטביות עבור דג teleost, במיוחד מבחינת מערכות מאגר pH osmolality. חשוב, לכן למדוד ולהתאים את הפתרונות לרמות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של פרמטרים אלה בהמינים של ריבית.
תרבויות יותרת המוח הראשי נעשו מתוך מספר teleost מיני דגים קרפיון מצוי (קרפיון carpio)2,3, דשא קרפיון (לאדלה Ctenopharyngodon)4, דג זהב (קרסיוס לדייק )5, פורל הקשת (Oncorhynchus mykiss)6, צלופח האירופית (אנגווילה אנגווילה)7, אמנון (Oreochromis mossambicus)8, דג זברה (רזבורה rerio)9, ו בקלה האוקיינוס האטלנטי (Gadus morhua)10. מלבד התאמת הטמפרטורה הדגירה המינים עניין, מספר פרוטוקולים אלה יש מודגרות התאים-מידע יונקים דמויי תנאים שעשויים להיות שיוצרת עבור המינים של עניין, עם pH מ- 7.2 7.5 באווירה humidified המכילה 3-5% CO2. בנוסף, זה לא ברור אם osmolality של פתרונות משתמשים להכנת מספר תרבויות התא הראשי אלה הותאמו ויציב בין פתרונות שונים.
בפרוטוקול הנוכחי מבוסס על העבודות הקודמות עם ראשי תרבויות בקלה האוקיינוס האטלנטי10 , ומורכב התאמות בטמפרטורת דגירה, osmolality, ה-pH pH מאגר מערכות, כולל את לחץ חלקי של פחמן דו חמצני (pCO2), כדי הפיזיולוגיה של medaka (O. latipes). Medaka הוא קטן (3-4 ס מ) דג של מים מתוקים, ילידי מזרח אסיה. בימים אלה, הוא משמש כמין מודל במעבדות מחקר רבים ברחבי העולם, כפי שהוא קל יחסית להתרבות, עמידים מאוד בפני רבים נפוצים דגים מחלות11. ישנם מספר יתרונות השימוש medaka כמודל, כולל עמידות בטמפרטורה של 4 – 40 ° C11, זמן דור קצר, העוברים שקוף, עם קביעת מין ג’ין12, קובצי רצף הגנום של13, וכן רבים אחרים זמינות משאבים גנטי.
תנאי התרבות העיקרי פרוטוקול זה המותאמים בצורה מיטבית כדי להתאים את הטמפרטורה של 26 ° C זה medakas נשמרים במתקן דגים. עוד יותר, osmolality מצומצמת מ- 320 mOsm/kg של בקלה האוקיינוס האטלנטי חי במים מלוחים עד 290 mOsm/kg במשך medaka לחיות במים מתוקים והוא בהתאם osmolality נורמלי של פלזמה medaka14. לשם השוואה, osmolality טיפוסי של פלסמה יונקים הוא בטווח של 275 – 295 mOsm15. הדג במגוון רחב של טמפרטורות ויש הזימים הנמצאים במגע ישיר עם המים, לעשות את יכולת ה-pH ומאגר של הדם, נוזל חוץ-תאי דגים שונים מאלה ביונקים. בתרבית של תרבות התקשורת כוללים בדרך כלל מערכות מאגר שתוצאתה pH של בסביבות 7.4 כאשר התקשורת הם equilibrated לאווירת רגיל של 5% CO2 באוויר humidified ב 37 º C. ה-pH הוא הטמפרטורה תלוי הערך עבור ה-pH נייטרלי (במים) עולה עם הטמפרטורה יורדת16. טיפוסי דגים teleost פלזמה pH נע בין 7.7 7.917. אופטימיזציה של פרוטוקול זה כללה ירידה מ- pH 7.85 בקלה שמרו ב 12 ° C ל pH 7.75 medaka המשיך בטמפרטורה 26 ° C על ידי הגדלת CO2 מ- 0.5% ל 1%.
בנוסף, היכולת מאגר ביקרבונט שונה לגמרי של דגים, יונקים. CO2 בקלות חילופי מעל הגג בדגים, ה pCO2 במים רק חלק קטן של pCO2 ב- ריאות18. שינוי הטמפרטורה או ה pCO2 תשנה את ה-pH ואת מאגר של המדיום. כתוצאה מכך, ה-pH וגם ה pCO2 מומלצת המקננת בתרבית של תאים הוא אופטימלי תאי דגים, לכן, התקשורת התרבות ניתן למטב במערכות מאגר המכיל ערכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית דגים ו מינים מסוימים של עניין. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין התא הראשי של medaka pituitaries תרבויות, כוללים התאמות של דגירה טמפרטורה, osmolality, pH ו- pH מאגר מערכת, בנוסף אחרים פרמטרים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת הכנת התא הראשי תרבויות ממינים מידע שאינם יונקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במבחנה תא תרבות מערכות לספק כלים רבי-עוצמה עבור חוקרים לענות שפע של שאלות ביולוגיות שונות אם המשמשים את הדרך הנכונה1. חשוב לזכור כי התאים הפומבית איבדו את קשריהם עם התאים הסמוכים יתכן שהשגתם מאפיינים פונקציונליים שונים ממה שהיה להם במקור בתוך vivo. כדי להימנע להיות בס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט מומן על ידי אוניברסיטת הנורבגית מועצת המחקר של נורבגיה, מספר גרנט 243811 ו- 244461 (חקלאות ימית תוכנית) ומדעי החיים. אנו אסירי תודה לורדס טאן Carreon באוניברסיטה נורבגי למדעי החיים לשמירה על המתקן דגים.
Materials
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 µg/ml Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straigt tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles / insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
References
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2010).
- Ribeiro, L. P., Ahne, W. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro. In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).
- Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release. In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).
- Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).
- Chang, J. P., et al. Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies. General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).
- Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout – Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone. General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).
- Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release. General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).
- Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
- Lin, S. W., Ge, W. Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach. General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH. General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka – a model organism from the far East. Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Letters. 2 (12), (2016).
- Waymouth, C. Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells. In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).
- Cameron, J. N. Acid-base homeostasis – past and present perspectives. Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).
- Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms. Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).
- Perry, S. F., Tufts, B. L. . Fish respiration. , (1998).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone β-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Strandabø, R. A. U., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Verbalis, J. G. Brain volume regulation in response to changes in osmolality. Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).
