Preparação de uma cultura de célula primária de alta qualidade do peixe Pituitaries

Summary

Aqui descrevemos um protocolo para preparar e manter as culturas de células da hipófise primário de medaka (Oryzias latipes). As condições otimizadas no presente protocolo considerar parâmetros importantes, tais como temperatura, pH e pressão osmótica imitando as condições fisiológicas dos peixes, possibilitando resultados fisiologicamente mais significativos.

Abstract

Cultura de pilha primária é uma poderosa ferramenta comumente usada pelos cientistas para estudar as propriedades celulares e mecanismos de células isoladas em um ambiente controlado. Apesar das vastas diferenças na fisiologia entre mamíferos e peixes, protocolos de cultura de célula primária de peixe são frequentemente com base em condições de cultura mamíferos, frequentemente com apenas pequenas modificações. As diferenças ambientais afetam não só a temperatura do corpo, mas também soro sanguíneo parâmetros tais como a osmolaridade, pH e capacidade tampão de pH. Como meios de cultura celular e soluções de trabalho semelhantes são feitas para imitar as características do líquido extracelular e/ou soro de sangue para que uma célula é adaptada, é fundamental que esses parâmetros são ajustados especificamente para o animal em questão.

O atual protocolo descreve as condições de cultura primária otimizado para medaka (Oryzias latipes). O protocolo fornece etapas detalhadas sobre como isolar e manter saudável dissociado células da hipófise para mais de uma semana e inclui as seguintes etapas: 1. a adaptação da osmolalidade para os valores encontrados no plasma de sangue medaka, 2. a adaptação do temperatura de incubação à temperatura normal medaka (aqui na instalação de aquário) e 3. o ajuste do pH e bicarbonato buffer para valores comparáveis a outras espécies de peixes vivem em temperaturas semelhantes. Os resultados apresentados usando o protocolo descrito promovem resultados fisiologicamente significativos para medaka e podem ser usados como um guia de referência pelos cientistas fazer culturas de células primárias de outras espécies não-mamíferos.

Introduction

Cultura de pilha é uma das principais ferramentas usadas em pesquisa biológica molecular, proporcionando um excelente modelo sistema para responder perguntas biológicas diferentes, variando de fisiologia celular normal a droga triagem e carcinogênese¹. As células primárias, isoladas diretamente do tecido animal usando métodos enzimáticos e/ou mecânicos, são muitas vezes consideradas biologicamente mais relevantes do que linhas celulares como a resposta biológica pode estar mais perto a situação na vivo . Protocolos para a preparação de culturas de células primárias devem ser otimizados para cada tipo de espécie e célula de interesse, a fim de imitar as características para que uma célula é adaptada e obter resultados significativos fisiologicamente.

Inúmeros protocolos descrevem as condições de cultura para sistemas de células de mamíferos, enquanto protocolos semelhantes descrevendo as condições de cultura primária de células de peixes são bastante escassos em comparação. As células são vulneráveis a mudanças rápidas de temperatura, pH e pressão osmótica e são particularmente frágeis durante o procedimento de dissociação. Soluções de sal comerciais e meios de cultura utilizados para culturas de células de mamíferos não são ideais para peixes teleósteos, especialmente em termos de sistema (s) tampão de pH e pressão osmótica. É, portanto, importante medir e ajustar as soluções aos níveis fisiologicamente relevantes desses parâmetros na espécie de interesse.

Foram feitas culturas primárias da hipófise de várias espécies de peixes teleósteos, incluindo a carpa comum (Cyprinus carpio)^2,3, capim (Ctenopharyngodon idella)⁴, peixe dourado (Carassius auratus deda carpa )⁵, truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss)⁶, enguia europeia (Anguilla anguilla)⁷, tilápia (Oreochromis mossambicus)⁸, peixe-zebra (Danio rerio)⁹, e Bacalhau do Atlântico (Gadus morhua)¹⁰. Para ajustar a temperatura de incubação para as espécies de interesse, além de vários desses protocolos têm incubadas as células em condições semelhantes a mamíferos que podem ser ideais para as espécies de interesse, com um pH de 7.2 a 7.5 em um ambiente umidificado contendo 3-5% de CO₂. Além disso, é claro se a pressão osmótica de soluções utilizadas para a preparação de várias destas culturas de célula primária foram ajustada e estável entre diferentes soluções.

O protocolo atual é baseado no trabalho anterior com culturas primárias do bacalhau do Atlântico¹⁰ e inclui ajustes de temperatura de incubação, osmolaridade, pH e sistemas-tampão pH, incluindo a pressão parcial de dióxido de carbono (pCO₂), para a fisiologia do medaka (o. latipes). Medaka é um peixe de água doce pequeno (3 – 4 cm), nativo do sudeste da Ásia. Hoje em dia, é usado como uma espécie de modelo em muitos laboratórios de pesquisa ao redor do mundo, como é relativamente fácil para procriar e altamente resistente a muitos peixes comuns doenças¹¹. Existem várias vantagens de usar o medaka como um modelo, incluindo uma tolerância de temperatura de 4 – 40 ° C¹¹, um tempo de geração curto, embriões transparentes, um sexo-determinando gene¹²e um genoma sequenciado¹³, bem como muitos outros recursos genéticos disponíveis.

As condições de cultura primária neste protocolo são otimizadas para coincidir com a temperatura de 26 ° C que medakas são mantidos na instalação de peixe. Além disso, a osmolalidade é reduzida de 320 mOsm/kg de bacalhau do Atlântico vivem em água salgada para 290 mOsm/kg para medaka vivem em água doce e de acordo com a osmolalidade normal de medaka plasma¹⁴. Em comparação, a osmolalidade típica dos mamíferos plasma está na faixa de 275-295 mOsm¹⁵. Vive em uma variedade de temperaturas e possuem brânquias que estão em contacto directo com a água, tornando a capacidade de buffer e o pH do sangue e fluido extracelular em peixes diferentes em mamíferos. Meios de cultura mamíferos geralmente incluem sistemas tampão que resultam em um pH de cerca de 7,4 quando a mídia está equilibrada para uma atmosfera padrão de 5% de CO₂ no ar umidificado a 37 ° C. O pH é dependente de temperatura e o valor de pH neutro (em água) aumenta com uma diminuição de temperatura¹⁶. Típico de peixes teleósteos plasma pH varia de 7,7 a 7,9¹⁷. A otimização do presente protocolo incluíram uma redução de pH 7,85 bacalhau mantida a 12 ° C pH 7.75 para medaka mantida a 26 ° C, aumentando o CO₂ de 0,5% a 1%.

Além disso, a capacidade de tampão bicarbonato é bastante diferente em peixes e mamíferos. CO₂ é facilmente trocado sobre as brânquias em peixes e o pCO₂ na água é apenas uma pequena fração da pCO₂ no pulmão¹⁸. Alterar a temperatura ou o pCO₂ alterará o pH e o tampão do meio. Consequentemente, o pH, nem o pCO₂ recomendado pela incubação de células de mamíferos é ideal para células de peixe e, portanto, os meios de cultura devem ser otimizados com sistemas tampão contendo valores fisiologicamente relevantes para os peixes e os determinada espécie de interesse. Este protocolo descreve como preparar culturas de células primárias de pituitaries medaka e incluem ajustes de pH, osmolaridade, pH e temperatura reserva do sistema de incubação, além de outros parâmetros importantes a considerar ao preparar a célula primária culturas de espécies não-mamíferos.

Protocol

As experiências com animais realizadas neste estudo foram aprovadas pela Universidade Norueguesa de Ciências da vida, seguir as orientações para o cuidado e bem-estar dos animais de pesquisa. 1. preparação de soluções Calibre os instrumentos de medidor de aparelhos e pH de acordo com as instruções do fabricante para garantir uma medição correta. Preparar 500 mL de Ca2 +- e Mg2 +-livre fosfato salino de Dulbecco (dPBS), ajustar o pH…

Representative Results

Este protocolo descreve a preparação de uma cultura de célula primária de pituitaries medaka e fornece as células saudáveis que podem ser mantidas em uma cultura pelo menos uma semana. O protocolo é baseado em valores correspondentes fisiológicos medaka14 e além disso é otimizado para o tecido da hipófise em peixes adultos, usando um pH de 7.75 e uma osmolalidade de 290 mOsm/kg durante todo o procedimento desde a colheita de tecidos para o chapeado célu…

Discussion

Sistemas de cultura in vitro células fornecem ferramentas poderosas para os investigadores responder a uma infinidade de questões biológicas diferentes se usado no caminho certo¹. É importante lembrar que células dissociadas que perderam suas conexões com as células vizinhas ter obtido diferentes propriedades funcionais do que tinham originalmente em vivo. Para evitar ser correndo o risco de má interpretação dos resultados obtidos em experimentos em vitro , é …

Materials

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	D8537	Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.
L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	L5520	Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).
NaOH	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5881	Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.
NaHCO3	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5761	10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium.
D-mannitol	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	63565	Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.
D-glucose	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	G5400	4.5 mM  D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium.
GlutaMAX Supplement	Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)	35050-061	Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium.
Penicillin-Streptomycin	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	P0781	Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 µg/ml Streptomycin).
Trypsin type II-S	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	T7409	Prepare 1 mg/ml in dPBS solution.
Trypsin inhibitor type I-S	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	T6522	Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below).
Dnase I	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	D5025	Use in trypsin inhibitor solution (see above).
0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system	Corning Inc. (Corning, NY)	431097	Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.
35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-10-C	Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools (CA)	11254-20	Straigt tip
Dumont #5/45 fine forceps	Fine Science Tools (CA)	11253-25	Angled 45° tip
Stereo microscope SZ61	Olympus Corp. (Tokyo, Japan)		Use for dissection of pituitaries.
Alegra X-22R Centrufuge	Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)		With cooling option (similar to current model XR-30).
Water bath	Techne (Staffordshire, UK)		Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.
Pasteur glass pipettes	VWR (NY)	612-1701	Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.
Galaxy MiniStar table centrifuge	VWR (NY)	521-2844	Any small table centrigue will do.
Fine needles / insect pins	Fine Science Tools (CA)	26001-40	Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.
Wax plate			Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.