Preparación de un cultivo de alta calidad primaria celular de peces Pituitaries
Summary
Aquí se describe un protocolo para preparar y mantener cultivos primarios de células hipofisarias de medaka (Oryzias latipes). Las condiciones optimizadas en este protocolo consideren parámetros importantes como la temperatura, osmolaridad y pH imitando las condiciones fisiológicas de los peces, permitiendo resultados fisiológico más significativos.
Abstract
Cultivo celular primario es una potente herramienta comúnmente utilizada por los científicos para estudiar propiedades celulares y mecanismos de las células aisladas en un entorno controlado. A pesar de grandes diferencias en la fisiología entre mamíferos y peces, protocolos de cultura de célula primaria del pescado se basan a menudo en condiciones de cultivo mamíferos, a menudo con sólo pequeñas modificaciones. Las diferencias ambientales afectan no sólo la temperatura corporal, sino también parámetros de suero de sangre como la osmolalidad, pH y capacidad amortiguadora de pH. Como medios de cultivo celular y similares soluciones de trabajo están pensadas para mímico las características del líquido extracelular y/o suero de la sangre a la que una célula se adapta, es crucial que estos parámetros se ajustan específicamente al animal en cuestión.
El protocolo actual describe las condiciones optimizadas en cultivo primario de medaka (Oryzias latipes). El protocolo proporciona pasos detallados sobre cómo aislar y mantener saludable disociaron las células pituitarias durante más de una semana e incluye los siguientes pasos: 1. la regulación de la osmolalidad a los valores encontrados en el plasma sanguíneo de medaka, 2. el ajuste de la temperatura de incubación a temperatura de medaka normal (aquí en las instalaciones de acuario) y 3. el ajuste del buffer de pH y bicarbonato a valores comparables a otras especies de peces que viven a temperaturas similares. Los resultados presentados utilizando el protocolo descrito promoción resultados fisiológicamente significativas de medaka y pueden ser utilizados como una guía de referencia por los científicos hacer cultivos celulares primarios de células de otras especies de animales no mamíferos.
Introduction
Cultivo de células es uno de los principales instrumentos utilizados en la investigación biológica molecular, proporciona un sistema modelo excelente para responder a diferentes cuestiones biológicas que van desde la fisiología celular normal a drogas proyección y carcinogénesis1. Células primarias, aisladas de los tejidos animales mediante métodos enzimáticos o mecánicos, a menudo se consideran biológicamente más relevantes que las líneas celulares como la respuesta biológica puede estar más cerca de la situación en vivo . Protocolos para la preparación de cultivos celulares primarios deben ser optimizados para cada tipo de célula y especies de interés para imitar las características para que una célula se adapta y obtener resultado fisiológico significativo.
Numerosos protocolos describen las condiciones de cultivo para los sistemas de células de mamífero, mientras que protocolos similares que describen las condiciones de cultivo primario de células de peces son bastante escasos en comparación. Las células son vulnerables a cambios rápidos de temperatura, el pH y la osmolalidad y son particularmente frágiles durante el procedimiento de disociación. Soluciones de sal comerciales y medios de cultivo utilizados para los cultivos de células de mamífero no son óptimos para los peces teleósteos, especialmente en términos de sistemas tampón de pH y la osmolalidad. Por lo tanto, es importante medir y ajustar las soluciones a niveles fisiológicamente relevantes de estos parámetros en las especies de interés.
Se hicieron cultivos hipofisarios primarios de varias especies de peces teleósteos, como la carpa común (carpio de Cyprinus)2,3, hierba (Ctenopharyngodon idella)4, goldfish (Carassius auratus dela carpa )5, trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)6,7de anguila europea (Anguilla anguilla), tilapia (Oreochromis mossambicus)8, pez cebra (Danio rerio)9, y Bacalao Atlántico (Gadus morhua)10. Aparte de ajustar la temperatura de incubación para las especies de interés, varios de estos protocolos incuban las células en condiciones similares a mamíferos que pueden ser subóptimas para la especie de interés, con un pH de 7.2 a 7.5 en un ambiente humidificado que contiene 3-5% CO2. Además, es confuso si la osmolalidad de las soluciones utilizadas para la preparación de varios de estos cultivos celulares primarios de células se ajustaron y estable entre diferentes soluciones.
El actual protocolo se basa en trabajos previos con cultivos primarios de bacalao del Atlántico10 y cuenta con ajustes de temperatura de incubación, osmolalidad, pH y sistemas buffer de pH, incluyendo la presión parcial de dióxido de carbono (pCO2), a la fisiología de medaka (o. latipes). Medaka es pequeña (3 – 4 cm) pez de agua dulce, nativo de Asia oriental. Estos días, se utiliza como una especie de modelo en muchos laboratorios de investigación alrededor del mundo, ya que es relativamente fácil de criar y muy resistente a muchos comunes peces enfermedades11. Hay varias ventajas de utilizar medaka como un modelo, incluyendo una tolerancia a la temperatura de 4 – 40 ° C11, un tiempo de generación corto, embriones transparentes, una determinación de sexo genética12y un genoma secuenciado13, así como muchos otros recursos genéticos disponibles.
Las condiciones de cultivo primario en este protocolo están optimizadas para que coincida con la temperatura de 26 ° C que medakas se mantienen en el fondo de pescado. Además, la osmolalidad es reducida de 320 mOsm/kg de bacalao del Atlántico viven en agua salada a 290 mOsm/kg para medaka viven en agua dulce y está de acuerdo con la osmolalidad normal del plasma de medaka14. En comparación, el típico osmolalidad del plasma mamífero está en el rango de 275 a 295 mOsm15. Vive en una gran variedad de temperaturas los peces y tienen branquias que están en contacto directo con agua, lo que la capacidad tampón y pH de la sangre y el líquido extracelular en peces diferentes de los de mamíferos. Medios de cultivo de mamíferos suelen incluir sistemas de tampón que se producir en un pH de aproximadamente 7.4 los medios de comunicación están equilibrados para una atmósfera estándar de 5% CO2 en aire humidificado a 37 ° C. El pH es dependiente de la temperatura y el valor de pH neutro (en agua) aumenta con una disminución de la temperatura16. PH del plasma de peces teleósteos típico oscila entre 7.7 y 7.917. La optimización de este protocolo incluye una reducción de pH 7.85 bacalao mantenido a 12 º C a pH 7.75 medaka mantenida a 26 ° C al aumentar el CO2 de 0,5% a 1%.
Además, la capacidad de buffer de bicarbonato es muy diferente en los peces y mamíferos. CO2 se intercambian fácilmente por las branquias en los peces y la pCO2 en agua es sólo una pequeña fracción de la pCO2 en el pulmón18. Cambio de la temperatura o la pCO2 va a cambiar el pH y el tampón del medio. En consecuencia, ni el pH ni la pCO2 se recomienda para la incubación de células de mamíferos es óptimo para las células de los peces, y por lo tanto, los medios de cultivo debe ser optimizado con sistemas buffer que contiene los valores fisiológicamente relevantes para los peces y la especie particular de interés. Este protocolo describe cómo preparar cultivos celulares primarios de células de pituitaries medaka e incluir ajustes de la incubación temperatura, osmolaridad, pH y pH buffer sistema, además de otros parámetros importantes a considerar cuando se prepara la célula primaria cultivos de especies no mamíferos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sistemas de cultivo in vitro de la célula proporcionan potentes herramientas para los investigadores responder a una plétora de diferentes cuestiones biológicas si se utiliza en la forma correcta1. Es importante recordar que las células disociadas que han perdido sus conexiones con las células vecinas pueden han obtenido diferentes propiedades funcionales que originalmente tenían en vivo. Para evitar riesgo de malinterpretando los resultados obtenidos en experimentos en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por la Universidad Noruega de Ciencias de la vida y el Consejo de investigación de Noruega, número de concesión 243811 y 244461 (programa de acuicultura). Agradecemos a Lourdes Carreon Tan en la Universidad Noruega de Ciencias de la vida para el mantenimiento de las instalaciones de peces.
Materials
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 µg/ml Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straigt tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles / insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
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