魚脳下垂体から質の高いプライマリ細胞培養の準備
Summary
ここで準備し、メダカ (メダカ) からプライマリ下垂体の細胞培養を維持するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルの最適化条件はそれにより生理学的より意味のある結果を有効にする、魚の生理学的条件を模倣して考慮温度、浸透圧、pH などの重要なパラメーターを取る。
Abstract
一次電池文化は、制御された環境で隔離されたセルの携帯電話の特性と機構を研究する科学者によってよく使用強力なツールです。哺乳類と魚の生理学の広大な相違にもかかわらず、魚からの一次電池文化プロトコルはしばしば哺乳類培養条件、頻繁に唯一のマイナーな変更に基づいてください。環境の違い、体温だけでなく、浸透圧、pH、pH 緩衝能など血清パラメーターに影響を与えます。細胞培養媒体と同様の作業ソリューションは、細胞外液や血清をセルが適応の特性を模倣する意味が、それは問題の動物にこれらのパラメーターが調整されることが重要です。
現在のプロトコルには、めだか (メダカ) の最適培養条件がについて説明します。プロトコルが特定し、健康を維持する方法の詳細については、1 週間以上の下垂体細胞を解離を提供し、次の手順が含まれています: 1 めだか血血しょう、2 値に浸透圧の調整が見つかりました。 の調整、。通常メダカ温孵化の温度 (ここの水族館施設で)、および 3。温度変化が同じ他魚種に匹敵する値を pH と炭酸バッファーの調整。記述のプロトコルを使用して示された結果は、めだかの生理学的意味のある結果を促進し、非哺乳類の他の種からの一次電池文化の科学者たちによってリファレンス ガイドとして使用できます。
Introduction
細胞培養は、通常細胞生理学から創薬スクリーニングと発癌の1に至るまでさまざまな生物学的質問に答えるためのエクセレント モデル システムを提供する分子の生物学的研究で使用される主なツールの 1 つです。初代培養細胞、酵素および/または機械的方法を使用して動物の組織から直接分離はしばしば生物学的反応は生体内での状況に近いかもしれません、細胞よりもっと生物学的関連と見なされます。一次電池文化の準備のためのプロトコルはセルが適応する特性を模倣し、生理学的意味のある結果を取得するために関心の種とセルの種類に対して最適化必要があります。
多数のプロトコルは、魚類細胞の培養条件を記述する類似したプロトコルは比較ではなく希少哺乳類細胞用培養条件を説明します。細胞、浸透圧、pH、温度の急激な変化に弱い、特に壊れやすい解離している最中です。市販の塩溶液と哺乳類の細胞培養用培地は pH バッファー システムと浸透圧の面で特に、魚類の最適化されていません。したがって、測定し、関心の種でこれらのパラメーターの関連する生理学的レベルの解決策を調整することが重要です。
初代の下垂体培養は、コイを含む複数の魚類の種から作られている (コイ)2,3草鯉 (ソウギョ idella)4金魚 (キンギョ)5レインボー ・ トラウト (オンコルヒュンクス)6、ヨーロッパのウナギ (アンギラ)7ティラピア (外部 mossambicus)8ゼブラフィッシュ (動脈分布)9と大西洋タラ (ガドゥス モルア)10。興味の種に孵化の温度を調整する、離れて加湿雰囲気で 7.5 7.2 から pH を有する興味の種の最適ではないことができる哺乳類のような条件下で細胞を培養がこれらのプロトコルのいくつか3-5% CO2を含みます。さらに、それは明白でなくこれらの一次電池文化のいくつかを準備するために使用されるソリューションの浸透圧が調整された場合、異なるソリューション間では安定です。
現在のプロトコル大西洋タラ10から初代培養前の仕事に基づいておりに孵化の温度、浸透圧、pH、および (pCO2) の二酸化炭素の分圧を含む pH バッファー システムの調整を含むめだか (O. 学) の生理。めだかは小さい (3-4 cm) の淡水魚、東アジア原産です。これらの日、それは比較的簡単に繁殖と多くの共通の魚の病気11に強いと、世界中の多くの研究所のモデル種として使用されます。ある 4-40 ° C11短い世代時間、透明な胚、性決定遺伝子12、および配列されたゲノムの13と同様、多くの温度許容値を含むモデルとしてめだかを使用していくつかの利点他利用可能な遺伝資源。
このプロトコルでは初代培養条件は、medakas は、魚の施設内に保管されている 26 の ° C の温度に合わせて最適化されています。さらに、浸透圧は 290 mOsm/kg 新鮮な水に住んでいるメダカのために食塩水に住んでいる大西洋タラから 320 mOsm/kg からは減り、めだかプラズマ14正常浸透圧に従っています。比較では、哺乳類のプラズマの代表的な浸透圧は 275-295 mOsm15の範囲内です。いろいろな温度で生活を魚し、哺乳類のものとは異なる魚の血液と細胞外液の pH とバッファー容量を作り、水との直接接触は、エラがあります。哺乳類の文化メディアには通常メディアが 37 ° C で加湿空気中 5% CO2の標準的な雰囲気に包まれた平衡時の pH は 7.4 前後の結果バッファー システムが含まれますPH は温度に依存し、減少温度16(水) で中性の pH 増加の値です。典型的な魚類 7.9177.7 から血漿 pH の範囲です。このプロトコルの最適化には、cod pH 7.75 めだか 0.5% から 1% に CO2を増やすことによって 26 の ° C で保管用に 12 ° C で保管のため pH 7.85 から削減が含まれています。
さらに、重炭酸塩の緩衝能が違う魚や哺乳類の。魚の鰓上 CO2の交換が簡単に水で pCO2肺18pCO2の小さい一部分だけです。温度または pCO2のいずれかを変更すると、pH および媒体のバッファーが変更されます。その結果、pH も哺乳動物細胞の培養に適して pCO2魚類細胞に最適です、したがって、文化メディアは魚の生理学的に関連する値を含むバッファー システム最適化必要があり、興味の特定の種。このプロトコルはメダカの脳下垂体からの一次電池文化の準備、培養温度、浸透圧、pH、および pH バッファー システムの一次電池を準備する際に考慮すべきその他の重要なパラメーターに加えて調整を含める方法をについて説明します非哺乳類の種からの文化。
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro細胞培養システムは、右の方法1で使用する場合異なる生物学的質問の茄多に答える研究者のための強力なツールを提供します。彼らはもともとの体内よりも、隣接セルへの接続を失っている解離細胞が異なる機能特性に取得したことを覚えていることが重要です。危険を冒しての in vitroの実験から得られた結果を誤って解釈されているように、興?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトはノルウェー大学生命科学許可番号 243811 と 244461 (養殖プログラム)、ノルウェーの研究評議会によって賄われていた。魚施設を維持するため生命科学のノルウェー大学ルルド ・ キャリオン タンに感謝しております。
Materials
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 µg/ml Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straigt tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles / insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
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