Summary
このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S. pneumoniae)フィブロネクチンと。
Abstract
近年, 原子間力顕微鏡 (AFM) と単一分子力分光法 (SMF) の分子特性と機能の私達の理解を拡張しました。それは私たちに詳しくホストの表面の受容器にどのように細菌アドヘシン バインドなど、生物物理学的メカニズムの多様性を探索する機会を与えた。その他の要因の間で SMF 実験の成功は、固体表面と原子間力顕微鏡のチップで興味の分子の機能とネイティブの固定化に依存します。ここでは、順序でシラン ペグ carboxyls と定評の N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) 化学を用いたシリコン表面に蛋白質の共有カップリングの簡単なプロトコルについて述べる細胞外マトリックス蛋白質フィブロネクチン (Fn) グラム陽性菌の肺炎球菌(S. pneumoniae) から線毛 1 付着性 RrgA の相互作用を探索できます。ガラス表面に Fn の均一な分布と AFM カンチレバー先端、SMF の中に相互作用イベントの最大 20% のターゲット値によって明白に RrgA の適切な濃度に表面の機能化をリードすることが分かった測定 RrgA Fn に 52 pN の平均力と結合することを明らかにしました。プロトコルは、カップルのサイト経由で特定の無料チオール グループに調整できます。これは定義済みの蛋白質または分子配向の結果し、SMF のほか他の生物物理アプリケーションに適しています。
Introduction
光と磁気ピンセットの横に原子間力顕微鏡 (AFM)1,2分析および分子を操作する便利なツールとして浮上しているし、プローブのプロパティおよび関数、外部力3 への対応を含む ,4。対照的に酵素結合抗体法 (elisa 法) のような方法は、表面プラズモン共鳴 (SPR) または水晶発振子マイクロ バランス (QCM) セットアップは、原子間力顕微鏡により分子 (SMF)5単一セルのレベル (SCFS)6 上の相互作用を測定するには.これらの技術をもたらした Fn黄色ブドウ球菌結合タンパク質で形成されたエシェリヒア属大腸菌線毛の蛋白がマンノース7、またはタンデム β ジッパーと FimH を繰り返すの相互作用の発見キャッチ債のようなバインド メカニズムに貴重な洞察力Fn8へのバインド時に。最近毛 1 付着性 RrgA9,10グラム陽性菌の肺炎球菌(S. pneumoniae)11からはフィブロネクチン12にバインドすることを示すことができましたその二つのターミナル ドメイン。これはタンデム β ジッパーとは異なりますし、毛肺炎球菌を形成し、一時的なフィブロネクチン含有の問い合わせ先ホスト面13を維持するを有効にする可能性があります新しい 2 ドメイン バインド メカニズムを明らかにしました。
SMF の実験の成功は、批判的に固体表面と原子間力顕微鏡のチップで生体分子の機能とネイティブの固定化に依存します。高い力に SMF 測定中に起こりうる、蛋白質は、できればにおいて、表面に共有に結合する必要があります。たくさんの異なる結合蛋白質と他の生体分子だけ (無機) 固体表面、ナノ粒子と文学14,15 に記載されているその他のデバイス上の全体のセルでの固定化法 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24、 25,26,27。これらのプロトコルは、多くの場合、有害物質の使用、実行および/または特別な装置 (例えば、プラズマ クリーナー) を必要とすることは困難です。カップル分子のガラスにする簡単な方法は、片側シラン反応グループと彼らの他の側にアミン反応性グループ ポリマー層が厚く heterobifunctional 塗料の硬化剤を添付することです。アプリケーションによっては、カップリング剤は例えば可変長の柔軟なハイドロ カーボン鎖を含めることができます。、ヒドロキソアルミニウム ポリエチレング リコール系 (PEG)。彼らは表面修飾した (例えば、疎水性、静電気とファン ・ デル ・ ワールス相互作用) の非特異的相互作用を抑制し、結合分子の回転自由度を提供することがあります。
ここでは、1 つまたは複数の自由なアミノ グループを含んでいる蛋白質の結合の結合のための一般的なプロトコルについて述べる (-NH2) ガラス表面し、窒化ケイ素原子間力顕微鏡のヒントを介してheterobifunctional エトキシ シラン-ペグ-カルボキシル基 (-COOH)。SMF の実験で、例示されている RrgA と Fn の細胞外マトリックス蛋白の相互作用に基づくこのプロトコルを使用することができます (概要については図 1を参照)。
最初のステップは、表面28,29,30,31のシリル化です。それは反応性の高い SiOH グループを形成するためにカップリング剤のエトキシ グループの加水分解を含みます。これらは、基板上 SiOH グループと反応できます。主凝縮でのステップは、これらの silanols の水素結合を形成し基板の上に広げ。(これは通常熱または水を削除する真空が必要) 二次縮合反応のシロキサン結合が形成されます。これは、結果、共有添付有機シラン。
2 番目の手順は、機能する蛋白質の結合 (-COOH) ポリマー32から拡張するグループ。まず、酸は確立された NHS/EDC を通して得られた反応性 N hydroxysuccinimid (NHS) エステル中間に変換されます (1-エチル - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid 化学33求核置換反応を受けると最終的に蛋白質の第一級アミンとアミド結合を形成します。
このように RrgA はシリコン窒化 AFM チップとランダムな方向にガラス基板を人間の Fn を連結した、単一分子レベルでの相互作用力を行った。ガラス表面に Fn の均一な分布と先端、SMF の測定時に発生する相互作用の最大 20% のターゲット値で明らかに RrgA の濃度を適切に説明した表面化学をリードすることが分かった。この化学非特異の相互作用を低減、データ集録中に少し変更する場合は、したがって見事正確な SMF 実験に適しています。
Protocol
1. 機能性シラン カップリング剤によるタンパク質の固定化
注:図 1は、この議定書に適用される表面の化学上の概要を示します。
注意: 次のプロトコルで腐食性、皮膚刺激性のプロパティを持つ別の化学物質が使用されます。適切な (耐酸性) 手袋、安全ゴーグルと白衣を着用し、蒸気の吸入を避けるためにソリューションを準備している間ヒューム フードの下で動作します。
- シラン カップリング剤とシリコン窒化カンチレバーや、ガラス表面の高機能化
- 粗塵を削除し、イソプロパノールと糸くずの精度でスライド ガラスから汚染ワイプ、スライドを (省略可能) 必要なサイズにカットします。
注: ガラス、横にある固体の表面できます石英、シリカ、アルミニウム、銅、スズ、チタン、鉄、クロム、ジルコニウム、ニッケル、亜鉛の酸化物。
注意: スライド ガラスを切るシャープなエッジがあります。 - 場所のガラス スライド染色瓶に塩酸でいっぱい (33 %hcl) 二重蒸留水 (ddH2O) 3-5% (v/v) で希釈し、適切なふた付きの瓶を閉じて、室温で 90 分用超音波洗浄槽にそれを置きます。
メモ: 使用される jar は、直径 6 cm、65 〜 70 mL のおおよそのサイズ。Jar の希釈 HCl の適切な量は 5 mL を含む 50 mL 33 %hcl と ddH2o ・ 45 mLHCl は効果的に非結合金属イオン、特にナトリウム、カリウム、カルシウムを削除し、水酸基飽和ガラス表面を生成するために、シリコンを低減します。
注意: 塩酸は腐食性、皮膚刺激性です。十分な酸抵抗力がある手袋を着用、安全メガネおよび研究室コート蒸気の吸入を避けるためにソリューションを準備している間ヒューム フードの下で動作します。 - AFM 先端の上向きできれいなガラスのスライドにプローブをカンチレバーし、紫外線の少なくとも 90 分上から光を照射窒化ケイ素を配置します。
メモ: 単一分子力分光法、0.01、0.1 N m-1の名目のバネ定数のカンチレバーは適しています。紫外光を用いたカンチレバー表面の照射は有機汚染物質、主に脂肪物質を削除し、1 つの側面に親水性にレンダリングします。反対側を重く汚染された - 場合は、ないはずや SMF 計測カンチレバー プローブのサプライヤーのボックス - 新鮮な使用される場合それ影響を与える可能性があります。多くの研究34で使用されています、ピラニアのソリューションを使用して全体のカンチレバー チップの徹底的なクリーニングを助けるかもしれない。
注意: 紫外光は目に有害であります。したがって、カンチレバー プローブの照射は、UV の光不透過性室で実施されなければなりません。ピラニア ソリューションは、反応性の高い皮膚、紙、その他の有機物を燃やすことができます。プラスチック製の容器は使用しないでください。料理や少量の有機表面汚染 (例えば、前の使用から) とも jar ファイルに配置されている場合は、急速に反応があります。 - DdH2O ガラス表面乾燥し、戻って別の 10 分の超音波風呂、瓶を置きますをさせることがなく染色瓶に塩酸が複数回、塩酸を洗って、適切にそれぞれ 10 分の 2 つの水を交換交換酸。
- 一方で、エトキシ (またはメトキシ) シラン ポリエチレン グリコール酸を溶解 (Si (OC2H5)3-ペグ-COOH) 混合物のエタノールと ddH2O (v/v 95%/5%、酢酸で調整 pH 4.6) に最終濃度 0.1 mg mL-1。エタノールの蒸発を避けるために密封ソリューションを格納します。
注: シラン カップリング剤は、水分と温度に敏感です。したがって、低温 (-20 ° C) および乾燥した条件の下で不活性ガス (N2)、下はこのフィールドに格納する必要があります。フラスコを開く前に、シランが水和反応を最小限に抑えるために部屋の温度に達していることを確認してください、それによって反応基の不活性化。多数のさまざまな機能グループと異なるスペーサーの長さ Heterobifunctional ペグ カップリング剤があります。ランダム固定蛋白質を介しての遊離アミノ基 (NH2) エトキシ/メトキシシラン追加機能グループは、このプロトコルで記述としては NHS エステルで必要があります。NHS エステルとシラン剤の購入、横にこのような NHS エステルを得るために簡単な方法、カルボキシル基のグループをアクティブ化する (-COOH) と 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) と NHS (1.2.1 を参照してください。 と 1.2.2。)。
注意: エタノールは可燃性と皮膚の刺激です。酢酸は、可燃性、腐食性です。皮膚や目に反応性シランを取得しないように注意してください。適切な手袋、安全ゴーグルと白衣を着用し、蒸気の吸入を避けるためには発煙のフードの下で働きます。 - 2 つの独立したペトリ皿にシラン溶液を注ぐ、それぞれ 1 つのシャーレに準備されたカンチレバー プローブとスライド ガラスを配置、密閉するエタノールの蒸発を避けるためで 90 分間静止を孵化させなさい (例えばパラフィルム)部屋の温度。
注: ペトリ皿の最適なサイズは、カンチレバー プローブの数と修飾する必要がありますガラスのサイズに依存します。良いハンドリングと低試薬量の直径のサイズは 50 〜 60 ミリメートルです。カンチレバーの気液界面を貫通しながらカンチレバーの望ましくない曲げ加工を避けるために空気-水界面に 90 ° の角度で開催される必要があります。スライド ガラス (しかしないカンチレバー プローブ) の潜伏は、軌道シェーカーで必要に応じて実施することができます。 - 非連結のシラン化合物類を完全に洗浄する純粋なエタノールを含む 3 つの連続したビーカーのカンチレバーとガラス スライドをすすいでください。
注: 気液界面を貫通しながらカンチレバーの望ましくない曲げ加工を避けるためにカンチレバーは 90 ° の角度で開催される必要があります。 - 染色瓶ときれいなガラスのスライドと 110 ° c 30 分治療で片持ちに機能ガラス スライドを配置します。
注: 熱硬化共有結合性シロキサン結合の形成と水の除去を誘導します。ガラスとスライドは 1 つの側面にのみ機能化、コーティング面を適切に示す確認します。 - シラン処理ガラス サンプルを格納し、カンチレバー プローブ真空デシケータ 1 週間。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
- 粗塵を削除し、イソプロパノールと糸くずの精度でスライド ガラスから汚染ワイプ、スライドを (省略可能) 必要なサイズにカットします。
- シラン処理ガラスとシリコン窒化カンチレバーに蛋白質の乱数固定
注: カンチレバーの望ましくない曲げないカンチレバー プローブを負うべき 90 ° の角度で任意の気液界面を貫通しながら。- 準備ソリューション含む 42 mg mL-1 EDC のと 20 mg mL-1 NHS に標準リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 137 mM NaCl、KCl 2.7 mM、10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4、pH 7.4)。
注意: EDC は腐食性、皮膚刺激性、眼に対する重篤な損傷を引き起こすことができます。適切な手袋、安全ゴーグルと白衣を着用します。 - ソリューションを持つシラン コーティング ガラス スライドをカバー EDC/NHS 溶液の一滴シラン処理カンチレバー プローブを入れ、室温で 10 分間インキュベートします。
注: カンチレバー プローブの孵化、オリジナルの片持箱は適しています。Carboxyls の遊離アミノ基を介してタンパク質カップルに (-COOH) heterobifunctional シラン ペグ エージェントの - COOH のグループは広く使われている EDC/NHS 化学でアクティブ化します。EDC は、生理的な pH は次のステップでアミンに効率的な活用を可能にする「安定的」NHS エステルを形成カルボン酸に NHS をカップルします。 - 過剰な EDC/NHS を完全に洗浄するために 3 つの連続したビーカーで PBS で徹底的に片持ちとガラス スライドをすすいでください。
注: この洗浄工程は残りの EDC/NHS が架橋タンパク質として重要なは、それによりその機能を変更します。 - 活性ガラス スライドを孵化し、カンチレバー プローブ室温湿式チャンバー内で目的タンパク質溶液の滴で。タンパク質の濃度と潜伏期間は実験の要件を満たすように適応する必要があります。一般に、1 0.5 mg mL-1とインキュベーション時間 30 分から 2 時間の間に集中はほとんどの蛋白質に適しています。(スライド ガラス) のフィブロネクチンと (カンチレバー) 上毛 1 ヒント タンパク質 RrgA の場合 1.5 μ M と 3 μ M のモル濃度, と 2 h のインキュベーション時間十分です。
- スライド ガラスを洗うし、カンチレバーの自由な蛋白質を洗浄するために 3 つの連続したビーカーで PBS で徹底的にプローブします。
- トリス (ヒドロキシメチル) 残りの NHS エステル飽和-トリス緩衝生理食塩水 (TBS; 50 mM トリス、150 mM の NaCl、pH 7.6) 室温で 20 分間でプローブを配置することによって aminomethan。
注: この手順削減トリスのアミノ基がカンチレバーと基板表面に残りの活性 COOH のグループにバインドできるので、タンパク質の AFM の先端の機能面とガラスの間の望ましくない共有結合します。 - スライド ガラスを洗浄し、カンチレバー プローブ徹底的に PBS と店別ペトリ皿でそれらは使用するまで PBS で覆われています。
注: サンプル新鮮な準備する必要があります、同じ日を使用します。
- 準備ソリューション含む 42 mg mL-1 EDC のと 20 mg mL-1 NHS に標準リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 137 mM NaCl、KCl 2.7 mM、10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4、pH 7.4)。
2. 原子間力顕微鏡による単一分子力分光法
注: この作業の JPK インスツル メンツから原子間力顕微鏡を用いて、セット力 RampDesigner で定義された力距離曲線を得るためにの ups。
- 熱雑音法35片校正
注: 片持ち校正用製造元のマニュアルの手順に従ってください。ほとんどは、公称カンチレバー形状 (長さ、幅、厚さ) から計算は通常、非常に信頼性ではありませんおおよそばね定数サプライヤー状態を片持ち。正しいばね定数が重要な 3 通で下記片校正を実施と光レバー感度の平均値を使用し、バネ定数をお勧めします。実験と光レバー感度を使用して、その後 (pN) を強制し、ばね定数を平均値変換中ボルト (V) でカンチレバーのたわみ量を記録することができます。レーザー位置は片持梁 (反映されたレーザーの位置はフォト ダイオードに再調整することができます) に変更ない限り、ばね定数と光レバー感度は、実験の前後に決定できます。- 原子間力顕微鏡の試料ホルダーのクリーンでフレッシュなガラス スライドを修正し、PBS バッファーでそれをカバーします。
注: 校正実施されなければならない (例えばガラス) ハード面と実際の実験として同じバッファー。 - カンチレバー ホルダーで準備されたカンチレバー プローブを修正、AFM ヘッドに配置し、PBS バッファーのドロップでカンチレバーを慎重に濡れています。
注: カンチレバーのぬれは、キャリブレーション ガラス スライドとカンチレバーのそれにより望ましくない曲げの PBS バッファーに浸透中に現れる表面張力を減らします。 - PBS バッファーがまだ校正面から離れて、カンチレバーが完全に浸漬されるまでゆっくりと校正表面に向かって片を移動します。
- AFM のトップ ビュー光学顕微鏡を使用して、(可能なら) または倒立顕微鏡原子間力顕微鏡 AFM のレーザーをカンチレバーの裏側に位置する下に。レーザーをカンチレバー先端がある近くの終わり近くスポットの場所。
注: レーザー スポットは、片持ち梁の終点近くにする必要がありますが、それはまだカンチレバーに完全にする必要があります。光学顕微鏡が利用できない場合可視光レーザ ダイオード、赤外レーザー ダイオードのレーザー検出器カード一枚の紙を使用して、原子間力顕微鏡の頭の下に置くし、カンチレバーがあるカンチレバー チップのエッジに向かってレーザー スポットを移動、紙や検出器のカードにスポットが表示されるまで。レーザーを縁に平行移動します。スポットが消えたら、カンチレバー ・ アームです。線形カンチレバーの紙/検出器カードと移動 (紙/カードから消える) レバー腕に再びなるまでに戻ってそれに表示されるまでレバー腕の終わりに場所を移動します。三角形、カンチレバーの 2 本の腕間の中間にスポットを置き、紙/カードから見えなくなるまで、片持ち梁の端に向かって移動します。カンチレバーの長い軸に垂直にスポットを移動することによってカンチレバーの真ん中にあることを確認します。 - 反射レーザー光がフォト ダイオードの中心部に配置されているような方法で AFM の 4 象限検出器フォト ダイオードの位置を調整します。
注: 手順に従います: 検出ダイオード近くマイクロメータ ネジを使用してすべての 4 つの象限から合計信号を最大まで水平および垂直方向に、ダイオードを移動します。垂直偏向信号がゼロになるまで、垂直方向にダイオードを移動し、横方向の偏向信号がゼロになるまで水平方向にダイオードを移動します。シリコン窒化カンチレバー通常ゴールド コーティング、したがって 2 つの異なる熱膨張係数とバイメタルです。これは、結果、ソリューションで特に熱ドリフト (垂直偏向信号で明らかに)。測定中にこのドリフトの低減、キャリブレーションを開始する前に、数分間平衡システム全体をしましょう。 - Afm によるソフトウェアのキャリブレーション マネージャーを開き、熱雑音による片持ち感度とカンチレバーのばね定数を次のように調整。
- 慎重に基板表面に接近し、力距離曲線を記録します。
- 先端が基板表面との接触が撤回フォース カーブの急勾配の部分に直線のあてはめによる nm/V の光レバー感度を決定します。感度 pN/nm にカンチレバーのばね定数を変換できるようにします。
注: 収縮曲線の傾きは、ピエゾ旅行距離対です。(nm/V で測定) フォト ダイオード電圧の変化。 - 任意の表面の減衰を除外するためにカンチレバー約 100 μ m 以上の表面からカンチレバーのいくつかの熱雑音スペクトルを記録します。
- 熱雑音スペクトルの原子間力顕微鏡のソフトウェアによって提供される高調波発振器をあてはめによる pN/V におけるカンチレバーのばね定数を決定します。
- ゆっくりとカンチレバーを撤回、ソリューションから撤退します。
- 代替ガラス表面は固定された蛋白質を含む試料表面とカンチレバー校正に使用されます。確認カンチレバーと試料表面 (とそれによって蛋白質) スライド ガラスを変化させながら乾燥しないでください。
- 原子間力顕微鏡の試料ホルダーのクリーンでフレッシュなガラス スライドを修正し、PBS バッファーでそれをカバーします。
- 相互作用力の単一蛋白質のレベルの実験
- PBS バッファーが基板表面からまだ、カンチレバーが完全に覆われるまで、ゆっくりとサンプル表面に向かって湿ったカンチレバーを移動します。
注意: 実験中に熱ドリフトの低減、力の分光測定を開始する前に、数分間設定システム全体をさせてください。 - 表面に近づくし、試料表面の 250 の pN の接触力とさまざまな場所で複数の力距離カーブ (≥ 500) の 1 の接触時間を記録 s、2 μ m の撤回長さと収縮速度 1 μ m s-1。
注: 一般的な力分光法による調整では、製造元のマニュアルに従ってください。バリエーション: 後退速度は、5 μ m s-1と 0.1 の間増加荷重に応じて 406 動力学的データを計算する変えることができます。時間依存の結合強化を分析する対話時間を変えることができます。収縮速度を一定に保つには、代わりに 1 つは力定数 (力クランプ モード) を維持可能性があります。
- PBS バッファーが基板表面からまだ、カンチレバーが完全に覆われるまで、ゆっくりとサンプル表面に向かって湿ったカンチレバーを移動します。
- データ分析
注: データ処理ソフトウェアを使用してデータ解析を行った。固定された蛋白質、接触時間または収縮速度、またはないかどうかフット プリントを設立、他の可変パラメーターに応じて力距離曲線には複数の異なる情報が含まれて。データ分析と解釈、さまざまな SMF 実験によって大きく異なる、したがって、ここでは詳しくは説明しませんが。RrgA と Fn の相互作用に関しては次のプロトコルは、SMF データの分析のための最初のステップをすることができます。- 開いているバッチを強制的にスキャンのアイコンを選択して測定力曲線ファイルを開き、力距離曲線を次のように処理します。
- (Re) 調整感度の調整とばね定数による V たわみアイコンを選択して直接比例した力 (F) をカンチレバーのたわみ量 (V) に変換します。
注: 片持ち校正は実験前に実施された、値がスキャン ファイルに保存され、V たわみの校正中に自動的に使用されます。実験後、キャリブレーションを行った、測定値に変更することができます既定の値が使用されます。 - 基線の減算のアイコンを選択してゼロの力のレベルを設定するために表面まで力曲線の領域で撤回チャネルのベースラインを減算します。
注: いくつかのケースで収縮がなく同じ一定の力値、カーブがオフセット + チルトを選択して削除できる線形傾斜を表示ことがあります。 - 先端がポイント決定のお問い合わせアイコンを選択して、サンプルと接触する取得ポイントを定義します。
- チップ-試料分離アイコンを選択して、tip サンプル分離に高さ信号を変換します。接触点位置を減算、に加えてこの手順は片持基板表面と AFM 先端間の距離を計算する曲げを減算します。
注: 拡張可能なワームような鎖モデルと相互作用の長さの決定のような高分子弾性モデルをフィッティングのための片持ち梁の曲げ修正チップ-試料の分離が必要です。力負荷力曲線と z 圧電速度の勾配から速度を決定するには、裸眼フォース カーブを使用してください。 - 破断距離 70 nm (伸ばされた PEG スペーサーの長さ)36非特異的な相互作用を整理し、選択して選択したピークに拡張可能なワーム様チェーン モデルを適用する上で発生する力のピークの力距離トレースを画面、高分子鎖モデルに合うアイコンと拡張ワームのようなチェーン モデルを選んだ。収縮力曲線のピークはこのモデルを搭載して、破断荷重、長さが得られるポリマーの弾性パラメーターと共に。
- 力と長さの分布を示すヒストグラムとしてデータを表示します。ヒストグラムの少なくとも 100 のバインド解除イベントを使用します。
Representative Results
プロトコル説明ここで共有結合固定化によるタンパク質の結果ランダムな方向 (図 1) とアクセスの第一級アミンの類。図 2 (左) とシラン処理ガラス表面の AFM 像を示しています、窒素の穏やかな流れの下でサンプルの脱水後 (右) Fn が固定化せずに記録。約 10 nm 高 Fn 分子が明らか (図 2左)、高分子シラン表面修飾と Fn の約 2-5 nm (図 2右) 中の高さとだけ小さな表面よりを示しています。クローズ アップ、Fn の二量体の構造を確認できます。Fn 分子にペグの表面コーティングの上 4-5 nm の高さの長さとコンパクトに見える 〜 120 nm (の挿入を参照してください)。
Fn は、最近私たちのグループ13で詳細に説明したと RrgA の相互作用力を調査するには、RrgA シリコン窒化 AFM 探針とガラス基板 (図 3 a) に人間の Fn に結合されていました。図 3は、代表的な先端に 1 μ m s-1の引き抜き速度で記録された Fn をもつ RrgA との相互作用の分離曲線のサンプルを示します。使用される表面化低バック グラウンド操作とチェーン (eWLC) モデル (赤いカーブ) のような拡張性のあるワームを使用して装着された (図 3 a)、形の良い単一 (または二重) 相互作用イベントにつながった。まで AFM 探針と基板、ペグ リンカー (> 70 nm) をストレッチと非特異的表面相互作用を克服した後は、フィット (破断力と - 長さ、図 4を参照) の結果をプロット力曲線の ~ 19% 示した破裂RrgA - Fn との相互作用の力の平均破裂イベント 〜 約 100 の tip サンプル距離で 52 pN nm。対照的に、適切でない表面化 (ここでは、生理食塩水図 3bをバッファリング トリスと省略された焼入) (トレース 2 と 3) をバインド複数タンパク質非特異的相互作用による単一の操作イベントの明確な評価の妨げになるおよび/またはタンパク質試料表面と原子間力顕微鏡のカンチレバー探針との間の共有カップリング。これは蛋白質 (Fn) の領域 (トレース 4 および 5) の展開を伴う可能性が高い破断力 (トレース 1) につながる。
図 1: 表面の化学上の概要。エトキシ シラン-ペグ-カルボキシル基の加水分解は、シロキサン架橋の形成と水和からす表面の結露が続きます。EDC のカルボキシル基との反応は水溶液 (加水分解) の半減期が非常に短いとアミン反応性中間反応o- acylisourea の結果します。中間は最終的に蛋白質の第一級アミンとアミド結合を形成する求核置換反応を受ける NHS エステルの形成による安定化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 固定ガラス基板を介してheterobifunctional エトキシ シラン ペグにフィブロネクチンのカルボキシル基剤。機能性ガラスの AFM 像 (左) と表面し、(右) なし Fn. 数字は個々 の Fn 分子を基板の表面 (挿入) で均一に配られます。分子がペグの上 4-5 nm の高さの二量体でコンパクトな構造を採用するコーティングとの長さ > 100 nm。これは、他のサーフェスは、雲母などの前の原子間力顕微鏡データを一貫性のあるソリューションで Fn の構造が似ている (インレイのスケール バー = 500 nm)37。AFM 下画像、AFM 画像に示されている線に沿って高さプロファイルです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: SMF 実験と代表のイラスト力 RrgA - Fn 相互作用の距離曲線。(a) RrgA と Fn された共有リンクを介してheterobifunctional エトキシ シラン ペグ AFM の窒化ケイ素にカルボキシル基カップリング剤カンチレバー探針とガラス表面、それぞれ。代表の SMF は、RrgA - RrgA と Fn の記述への固定化と 1 μ m s-1の収縮速度で Fn 相互作用の得られた曲線が表示される距離を強制します。赤いカーブは、破断荷重、長さを得るために適用する拡張可能なワームのようなチェーン フィットを表します。図は Becke、ら、ACSnano 201813から変更されています。(b) 代表の SMF は、生理食塩水 RrgA - tris バッファー焼入れなし Fn 相互作用の距離曲線を強制します。この場合、トリスの第一級アミンは欠席した NHS エステル不飽和実験中に残っていたので、残りのアクティブな。これはマルチ蛋白質 (トレース 2 と 3) をバインディングにつながったし、表面と高破断につながった AFM 先端間の蛋白質のクランプ力 (Fn-) を伴うドメイン展開 (トレース 1、4 および 5; 異なるスケールを注意してください)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 単一 RrgA - Fn 相互作用の力・長さ分布。破壊力と RrgA - Fn SMF の相互作用の測定から得られた対応する破断長ヒストグラム (n = 1400) 1 μ の-1の収縮速度で。ヒストグラムは、51.6 pN (ガウス適合、黒い線) の最もありそうな破壊力fMP破断長約 100 の蓄積を明らかにする nm。図は、らACSnano、2018年13Becke から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
SMF 原子間力顕微鏡の導入以来、直接プローブ内および個々 の蛋白質、核酸、その他生体分子3,4、5の分子間力に広く使われている手法に進化しました。SMF 実験に成功、適切なサーフェス結合戦略が必須です。天然および合成高分子の分子内力を調べるため、基板表面と AFM 先端36,38,39,40,41にポリマーを直接に結合可能性があります。分子の結合などの分子間相互作用の調査のために、しかし、それは AFM チップに相互作用パートナーを接続する適用範囲が広いリンカー分子ヘテロ二官能性 PEG リンカーまたはポリペプチド鎖などを使用することをお勧めし短距離の表面力を克服するために、変性や変性タンパク質21,22,23、ように結合パートナーの正しい向きを可能にするために、基板表面 24,25,26,27,42。我々 したがって、ヘテロ二官能性 PEG スペーサーを使用して自分のアクセスの第一級アミン蛋白質を介して共有結合固定化のためのシンプルでまっすぐ進むプロトコルを説明します。
適用性を示した我々 の相互作用の調査の双球菌肺炎球菌感染から RrgA と細胞外マトリックス蛋白 Fn の力として最近で詳しく説明他13。
表面の化学がよく確立され、分析と同様のアプローチは、複数の SMF 実験19,42,43,44,45で正常に使用されています。表面にシラン高分子を結合の使用 silylether は、加水分解が適用されます。加水分解の程度は、シリル化プロセス中に制御することができます形成されたシロキサン結合の量に依存します。高い相互作用力 (≥ 1000 pN) は、SMF の測定中に期待されて、シリル化は実行を介して気相蒸着30シロキサンの連続的な層の形成の結果をする必要があります。多くの実験 (例えば、多くのタンパク質-タンパク質相互作用) の相互作用力は数百の pN と記述されていたプロシージャ、するシロキサンの形成を液相からの蒸着法による実施し、非連結の範囲で有機シランは思慮深く熱 (ステップ 1.1.8) と硬化後のエタノール (ステップ 1.1.7) で洗い落とし、充分です。
もう一つの重要なステップです残りの EDC を洗うし、NHS 分子表面 (ステップ 1.2.3) をオフは、残り物は、蛋白質のカルボキシル基の活性化につながるよう。これは、その機能を変えることができる同一の表面タンパク質の架橋結合のどちらかの結果を可能性があります。 またはカップルが反対側の面の他の蛋白質に蛋白質を活性化しました。これは表面とドメイン展開を伴う可能性が高い破断力による AFM の先端の間の蛋白質のクランプにつながる可能性があります (図 3 b1、4、5 のトレースを参照してください Fn ドメインの展開)46。PEG スペーサーのアクティブな NHS エステル不飽和に残っている場合、同じ問題が発生することができます。したがって、トリス緩衝生理食塩水で孵化は推奨 (ステップ 1.2.6)、トリスの第一級アミンを消光残りアミノ反応性として。
シラン処理ガラスの Fn の均一な分布につながる段階のプロトコルに従う (図 2を参照)、表面蛋白質の二量体の形を残してします。これは溶液中の Fn´s の構造のような他サンプル表面37前の原子間力顕微鏡データと一致します。さらに、AFM の先端に RrgA の適切な濃度は、SMF の測定 (図 3および図 4) 中の明確な相互作用イベント 〜 20% のターゲット値を生成するに取得されます。タンパク質濃度および/またはインキュベーション時間を変化させる以外にもサンプル基板、カンチレバーの先端に結合分子の量を制御する別のエレガントな方法は、異なるセカンダリ官能基をもつシラン剤の組み合わせです。PEG ・ ポリマーから伸びる蛋白質反応基の割合を変更すると、固定された蛋白質の数は制御15,16,17,18をすることができます。
ここで説明されているプロトコルは、他 -NH2含む分子を固定化したり、ガラスとシリコン窒化以外にも他のシリコン酸化膜の表面にいくつか蛋白質を調整するも使用できます。タンパク質の設計によってアミン反応性のカルボキシル基に変更できますスルフヒ反応グループ (例えば、マレイミドまたはオルソ ピリジル二硫化)を介してタンパク質カップルにその無料-SH グループ。Fn、この定義済みの方向の13,17,20になります。
要約すると、このプロトコルはさまざまな要件を提供するために調整することができます、単一分子力分光実験以外にも他の生物物理アプリケーションに適しています。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
TB と HG 欧州研究評議会「Cellufuel、高度なグラント号 294438」を通じて支援を認めます。HCS は、Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt) を通じて教育研究のための中央政府大臣から財政支援を認めている SS が金融認めているバイエルン州省から科学と教育のためのサポートによって研究の焦点「Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - キャンター」。テクニカル サポート、コニー Hasselberg クリストフとマルチナ Hörig に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752 | |
| 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | 03450 | EDC |
| Acetic acid | Carl Roth | 3738 | 100 %; analytical purity |
| Doubly distilled water | |||
| Ethanol | Carl Roth | 9065 | ≥ 99.8 %; analytical purity |
| Ethoxy silane polyethylene glycol acid | Nanocs | PG2-CASL-5k | 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3 |
| Hydrochloric acid | Carl Roth | X896 | 32 % |
| N-Hydroxysuccinimid | Merck | 804518 | NHS; for synthesis |
| Phosphate Buffered Saline - Dulbecco | Biochrom | L1825 | PBS |
| Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma | Sigma-Aldrich | F1056 | |
| Probe molecule e.g. RrgA | Produced in laboratory | ||
| Sodiumchlorid | Carl Roth | 9265 | NaCl |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Carl Roth | AE15 | ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Beakers | |||
| Glass cutter | |||
| Glass slides | Carl Roth | 0656 | |
| Inert gas desiccator | Sicco | ||
| Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | ||
| JPK NanoWizard 1 | JPK Instruments | ||
| JPK NanoWizard SPM and DP software | JPK Instruments | ||
| Laboratory oven | Binder | ||
| Magnetic stirrer | IKA | ||
| Micro spatula | |||
| Microcentrifuge tubes | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Parafilm M | Brand | 701606 | |
| Petri dishes | |||
| pH-meter | Knick | ||
| Pipettes | Starlab | 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl | |
| Precision balance | Acculab | ||
| Silicon nitride cantilever - MLCT | Bruker AXS S.A.S | Spring constant ≤ 100 pN/nm | |
| Sonication bath | Bandelin | ||
| Staining jar | |||
| Stereo microscope - Zeiss Stemi | Zeiss | ||
| Stir bar | |||
| Kimtech science precision wipes | Kimberly-Clark | ||
| Twezzers | |||
| UV PenRay | UVP, LLC | 90-0012-01 | Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm |
| Vacuum desiccator | |||
| Vacuum pump | |||
| Vortex mixer | VWR | ||
| Weighing paper | Carl Roth | TP64 |
References
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