低聚活性的体外定量

Summary

我们描述了三种实验方法来评估化学物质在体外的低细胞化活性: 1) 细胞酪氨酸酶活性和 2) 黑色素含量的定量, 以及 3) 细胞黑色素染色和图像分析测量黑色素。

Abstract

本研究提出了体外低细胞化活性定量的实验室方法。黑色素是黑色素细胞中的主要色素, 是针对多种细胞和环境因素而合成的。黑色素保护皮肤细胞免受紫外线伤害, 但也具有生物物理和生化功能。黑色素细胞的过度产生或积累会导致皮肤病问题, 如雀斑、黑斑、黄瘤和痣。因此, 控制黑色素生成与低渗剂是重要的个人有临床或美容需求。黑色素主要是在黑色素细胞的黑色素体中合成的, 这个过程被称为黑色素生成, 它受到外部和内在因素的影响, 如激素、炎症、年龄和紫外线照射。我们描述了三种方法来确定化学物质或天然物质在黑素细胞中的低细胞化活性: 测量 1) 细胞酪氨酸酶活性和 2) 黑色素含量, 3) 染色和量化细胞黑色素与图像分析。

在黑色素生成过程中, 酪氨酸酶催化将 l-酪氨酸转化为 3, 4-二羟基苯基丙氨酸 (l-dopa), 然后转化为多巴基宁的限速步骤。因此, 抑制酪氨酸酶是一种主要的低细胞化机制。在培养的黑素细胞中, 通过添加 l-dopa 作为底物, 用分光光度法测定多巴西酮的产生, 可以量化酪氨酸酶活性。黑色素生成也可以通过定量测量黑色素含量。用 naoh 提取含黑色素的细胞分数, 用定量分光光度法提取黑色素。最后, 黑色素的图像分析可以量化黑色素的含量。虽然这些体外检测的结果可能并不总是在人体皮肤中复制, 但这些方法在黑色素生成研究中被广泛使用, 特别是作为识别潜在低细胞化活性的第一步。这些方法也可用于评估黑素细胞的活性、生长和分化。与三种不同方法一致的结果确保了效果的有效性。

Introduction

黑色素在包括皮肤、眼睛和大脑¹在内的几个器官的生理、病理和毒理学中发挥着至关重要的作用。黑色素的主要功能是光筛选和生化效应。黑色素吸收近红外光和可见光以及紫外线 (uv) 辐射, 在较短波长的光的情况下吸收率提高;因此, 黑色素保护组织免受可见光或紫外线辐射2造成的损害^.黑色素是一种抗氧化剂, 对金属和其他有毒化学品有亲和力;因此, 它可以保护组织免受氧化和化学应激3。然而, 黑色素的过度生产会导致皮肤病问题。

皮肤和虹膜中黑色素的数量和质量是虹膜和皮肤颜色的最重要决定因素。个人可能有不同的肤色偏好;有的喜欢晒黑的皮肤, 有的则喜欢较浅的皮肤颜色。根据这些消费者的情况, 低菌化妆品已经开发, 以满足个别市场的青睐的肤色⁴。因此, 研究低细胞和抗黑色素活性在科学和实践上都很重要。

黑色素生成是黑色素通过一系列酶性和自发化学反应在黑色素细胞中进行生物合成的复杂过程。一个黑素细胞被大约36个角质形成细胞包围, 黑素细胞是黑色素合成工厂, 将它们的产品分配给邻近的角质形成细胞。在皮肤中, 产生和储存在黑色素细胞黑色素瘤室中的黑色素通过树突输送到表皮中的角质形成细胞.

l-tyrosine 作为黑色素生成的初始底物, 酪氨酸酶催化两种连续反应, 将 l-酪氨酸转化为 3, 4-二羟基苯基丙氨酸 (dopa), 然后转化为多巴米酮。这些反应是黑色素生成的限速^{步骤 5,6}。因此, 低细胞分裂活性可以通过直接评估细胞酪氨酸酶活性来测量。为此, 含有酪氨酸酶的黑素细胞提取物由 dopa 孵育, 样品中产生的多巴西酮可在475纳米的分光光度法中进行测定。这些值通过样品的蛋白质浓度进行归一化, 与对照相比, 具有低渗活性的物质会导致多巴奎因的形成较少。

其次, 低细胞分裂活性可以通过直接测量培养的黑色素细胞中的黑色素来量化。用试验材料处理细胞后, 在碱性条件下提取黑色素, 用分光光度法在400纳米处测定黑色素含量。低细胞化剂会导致比对照组⁷更低的黑色素含量。

最后, 利用 Fontana-Masson 黑色素染色和随后的图像分析可以量化低细胞分裂活性。在 Fontana-Masson 染色中, 黑色素颗粒将硝酸铵还原为可见的黑色金属状态, 而微观图像中的黑细胞区域代表黑色素的数量。

低渗剂通常会给出与这三种方法一致和可比的结果, 这证实了该物质的活性是有效的。或者, 它可能是有用的, 以衡量关键基因和蛋白质在黑色素生成的表达, 以响应测试物质, 以检查低细胞化活性。除了酪氨酸酶外, 酪氨酸酶相关蛋白 (trp-1) 和多巴斯姆自体擦除 (trp-2) 是黑色素生成的关键酶 8.转录因子、微邻苯二甲相关转录因子 (mitf) 是黑色素生成和基因蛋白表达水平定量的主要调节剂, 也可用于评估低细胞化活性。

Protocol

1. 培养基、化合物和试剂的制备 准备 b16f10 生长完整的介质。补充 dulbecco 的改良鹰培养基 (dmem) 与10% 的胎牛血清 (fbs) 和1% 的青霉素/链霉素 (pest)。 要使500毫升的完整介质, 将 dulbecco 改性的 eagle 介质 (dmem) 的445毫升与50毫升的 fbs 和5毫升的 pest 混合在一个1升的灭菌玻璃瓶中。轻轻混合后, 通过0.2μm 的瓶盖过滤器将介质过滤到新的灭菌玻璃瓶中, 然后存放在4°c。注意: 所有细胞培养?…

Representative Results

具有代表性的结果, 在 b16f10 黑色素细胞的抗黑色素素化合物的低细胞分裂活性如下所示。图 1a显示, 与车辆处理的对照相比, arbutin 显著抑制了细胞酪氨酸酶活性。同样, 与对照组相比, 阿布丁刺激的细胞黑色素含量显著降低 (图 1b)。用 Fontana-Masson 染色染色的细胞的显微图像如图 1c所示。与对照相比, arbutin …

Discussion

我们提出了评估使用培养的黑素细胞的测试化合物的低细胞化活性的方案。有代表性的结果显示了抗酪氨酸酶抑制剂 arbutin 的低细胞化作用, 它抑制酪氨酸酶活性和细胞黑色素含量。这些方法在抗黑色素活性研究中得到了广泛的应用。利用这些检测方法, 我们还成功地发现了几种生物活性化合物, 这些化合物在过去^十年中对b16f10 细胞产生黑色素作用, 9^{、10</sup…}

Materials

3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU