Cuantificación de hipopigmentación de la actividad In Vitro
Summary
Se describen tres métodos experimentales para la evaluación de la actividad de hipopigmentación de químicos in vitro: cuantificación del contenido 2) melanina y actividad tirosinasa 1) celular y 3) medición de la melanina por análisis de imagen y coloración celular melanina.
Abstract
Este estudio presenta los métodos de laboratorio para la cuantificación de hipopigmentación de la actividad in vitro. Melanina, el pigmento principal en los melanocitos, se sintetiza en respuesta a múltiples factores ambientales y celulares. Melanina, protege las células de la piel contra el daño ULTRAVIOLETA, pero también tiene funciones biofísicas y bioquímicas. Producción excesiva o acumulación de melanina en los melanocitos puede causar problemas dermatológicos, tales como pecas, manchas, melasma y moles. Por lo tanto, el control de la melanogénesis con hipopigmentación agentes es importante en personas con necesidades clínicas o cosméticas. Melanina se sintetiza principalmente en los melanosomas de melanocitos en un proceso bioquímico complejo llamado melanogénesis, influenciado por extrínsecos y factores intrínsecos, como las hormonas, inflamación, edad y exposición a la luz ultravioleta. Se describen tres métodos para determinar la actividad de hipopigmentación de productos químicos o sustancias naturales en los melanocitos: medición de la actividad de la tirosinasa 1) celular y contenido de melanina 2) y melanina celular 3) tinción y cuantificación con imagen Análisis.
En la melanogénesis, tirosinasa cataliza el paso de limitación de velocidad que convierte la L-tirosina en 3, 4-dopa (l-dopa) y luego en dopaquinona. Por lo tanto, la inhibición de la tirosinasa es un mecanismo primario de hipopigmentación. En los melanocitos cultivados, actividad de la tirosinasa puede cuantificarse por la adición de l-dopa como sustrato y dopaquinona producción de medición por espectrofotometría. Melanogénesis puede medirse también cuantificando el contenido de melanina. La fracción celular que contiene melanina es extraída con NaOH y melanina se cuantifica espectrofotométricamente. Finalmente, el contenido de melanina puede ser cuantificado por análisis de imagen después de la coloración de Fontana-Masson de melanina. Aunque los resultados de estos ensayos in vitro no siempre se pueden reproducir en la piel humana, estos métodos son ampliamente utilizados en la investigación de la melanogénesis, especialmente como el paso inicial para identificar la potencial actividad de hipopigmentación. Estos métodos pueden utilizarse también para evaluar la diferenciación, crecimiento y actividad de melanocitos. Resultados consistentes con los tres diferentes métodos de aseguran la validez de los efectos.
Introduction
Melanina juega un papel fundamental en la fisiología, patología y toxicología de los varios órganos incluyendo la piel, ojos y cerebro1. Principales funciones de la melanina son efectos foto-proyección y bioquímicos. Melanina absorbe la luz infrarroja y visible, así como la radiación ultravioleta (UV), con tasas de aumento de la absorción en longitudes de onda más cortas de la luz; así, melanina protege los tejidos contra daños causados por la luz visible o UV radiación2. Melanina es un antioxidante y tiene una afinidad por los metales y otras sustancias químicas tóxicas; por lo tanto, puede proteger los tejidos del estrés oxidativo y química3. Sin embargo, la producción excesiva de melanina provoca problemas dermatológicos.
La cantidad y calidad de melanina en la piel y el iris son los más importantes determinantes del color del iris y la piel. Los individuos pueden tener preferencias de color de piel diferente; algunos favorecen la piel bronceada, mientras que otros favorecen colores de piel más claros. Dependiendo de estos perfiles de consumidor, hipopigmentación cosmética se han desarrollado para satisfacer mercados individuales de piel favorece colores4. En consecuencia, estudios de actividad hipopigmentación y anti-melanogenic son importantes científicamente y prácticamente.
Melanogénesis es el complejo proceso de biosíntesis de la melanina mediante una serie de reacciones químicas enzimáticas y espontáneas en los melanocitos. Un melanocito es rodeado por aproximadamente 36 queratinocitos y melanocitos son las fábricas de la síntesis de melanina que distribuyen su producto a los queratinocitos vecinos. En la piel, la melanina producida y almacenada en el compartimiento melanosomal de melanocitos es transportada a vecinos queratinocitos en las epidermis a través de las dendritas.
L-tirosina sirve como sustrato inicial para la melanogénesis y la tirosinasa enzima cataliza dos reacciones consecutivas que transforman la L-tirosina en 3, 4-dopa (DOPA) y luego en dopaquinona. Estas reacciones son el paso tarifa-limitador en la melanogénesis5,6. Por consiguiente, hipopigmentación actividad primero puede medirse determinando la actividad de la tirosinasa celular directamente. Para ello, extractos de melanocitos que contiene tirosinasa se incuban con la DOPA y la dopaquinona producida en las muestras se puede medir por espectrofotometría a 475 nm. Los valores se normalizan por las concentraciones de proteína de las muestras y sustancias con hipopigmentación actividad dan como resultado menos formación de dopaquinona en comparación con controles.
En segundo lugar, actividad de hipopigmentación puede cuantificarse midiendo directamente la melanina en los melanocitos cultivados. Después de tratar las células con el material de prueba, la melanina se extrae en condiciones alcalinas y el contenido de melanina se cuantifica por espectrofotometría a 400 nm. Un agente de la hipopigmentación se traducirá en un menor contenido de melanina que la de controles7.
Por último, la actividad de hipopigmentación puede cuantificarse por coloración de Fontana-Masson melanina y análisis de imagen posterior. En la tinción de Fontana-Masson, gránulos de la melanina reducen nitrato de amoníaco-plata en un visible estado metálico negro y las áreas negras de las células en los imágenes microscópicas representan la cantidad de melanina.
Un agente de hipopigmentación generalmente da resultados consistentes y comparables con estos tres métodos, que confirma que la actividad de la sustancia es válida. Alternativamente, puede ser útil medir la expresión de genes clave y proteínas en la melanogénesis en respuesta a una sustancia de prueba para examinar la actividad de hipopigmentación. Además de tirosinasa, proteínas relacionadas con la tirosinasa (TRP-1) y dopachrome tautomerase (TRP-2) son enzimas críticas en la melanogénesis8. El factor de transcripción factor transcripción asociada a microftalmia (MITF) es un regulador principal en la melanogénesis y cuantificación de sus niveles de expresión del gen de la proteína o un análisis de la actividad de promotor puede utilizarse también para evaluar actividad de hipopigmentación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han presentado protocolos para la evaluación de la actividad de hipopigmentación de prueba compuestos con melanocitos cultivados. Resultados representativos mostraron el efecto de hipopigmentación de la arbutina, un inhibidor de la tirosinasa que inhibió el contenido de melanina de celular y actividad de tirosinasa. Estos métodos son ampliamente utilizados en la investigación de actividad anti-melanogenic. Mediante estos ensayos, que con éxito hemos identificado varios compuestos bioactivos que tienen efectos i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Corea Instituto de planificación y evaluación de tecnología en alimentos, agricultura y silvicultura (IPET) a través del programa de desarrollo de tecnología de Agri-bioindustria, financiado por el Ministerio de agricultura, alimentación y asuntos rurales (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) y escuela de Ciencias de la vida y biotecnología BK21 Plus, Universidad de Corea.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
Riferimenti
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F. Melanin chemistry and the ecology of stress. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents – existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D’Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. Signaling pathways in melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
