Kvantificering af hypopigmentering aktivitet In Vitro
Summary
Vi beskriver tre eksperimentelle metoder til evaluering af hypopigmentering aktivitet af kemikalier in vitro: kvantificering af 1) cellulære tyrosinase aktivitet og 2) melanin indhold, og 3) måling af melanin af cellulære melanin farvning og billede analyse.
Abstract
Denne undersøgelse præsenterer laboratoriemetoder til kvantificering af hypopigmentering aktivitet in vitro. Melanin, den store pigment i melanocytter, er syntetiseret i svar til flere cellulære og miljømæssige faktorer. Melanin beskytter hudceller fra ultraviolet skader, men også har biofysiske og biokemiske funktioner. Overdreven produktion eller ophobning af melanin i melanocytter kan forårsage dermatologiske problemer, såsom fregner, mørke pletter, melasma og modermærker. Derfor er kontrol af melanogenesis med hypopigmentering agenter vigtigt hos personer med klinisk eller kosmetiske behov. Melanin er primært syntetiseret i melanosomer af melanocytter i en kompleks biokemiske proces, der kaldes melanogenesis, som er påvirket af ydre og iboende faktorer, såsom hormoner, betændelse, alder og ultraviolet lys eksponering. Vi beskriver tre metoder til at bestemme hypopigmentering aktiviteter kemikalieproducenter eller naturlige stoffer i melanocytter: måling af 1) cellulære tyrosinase aktivitet og 2) melanin indhold og 3) farvning og kvantificere cellulære melanin med billede analyse.
I melanogenesis katalyserer tyrosinase trinnet trafikhastighedsbegrænsning, der konverterer L-tyrosin i 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) og derefter ind i dopaquinone. Hæmning af tyrosinase er derfor en primær hypopigmentering mekanisme. I kulturperler melanocytter, kan tyrosinase aktivitet kvantificeres ved at tilføje L-DOPA som substrat og måling af dopaquinone produktion af spektrofotometri. Melanogenesis kan også måles ved kvantificere melanin indhold. Melanin-holdige cellulære brøken ekstraheres med NaOH og melanin er kvantificeret spektrofotometrisk. Endelig, melanin indhold kan kvantificeres ved billedanalyse efter Fontana-Masson farvning af melanin. Selv om resultaterne af disse in vitro-assays ikke kan altid gengives i menneskelige hud, er disse metoder almindeligt anvendt i melanogenesis forskning, især som det første skridt til at identificere potentielle hypopigmentering aktivitet. Disse metoder kan også bruges til at vurdere melanocyte aktivitet, vækst og differentiering. Ensartede resultater med de tre forskellige metoder sikrer gyldigheden af virkningerne.
Introduction
Melanin spiller en afgørende rolle i fysiologi, patologi og toksikologi af flere organer, herunder hud, øjne og hjerne1. Hovedfunktioner af melanin er foto-screening og biokemiske virkninger. Melanin absorberer nær-infrarødt og synligt lys samt ultraviolet (UV) stråling, med øget absorption satser ved kortere bølgelængder af lys; således beskytter melanin væv fra skader forårsaget af synligt lys eller UV stråling2. Melanin er en antioxidant og har en affinitet for metaller og andre giftige kemikalier; Derfor kan det beskytte væv fra oxidative og kemiske stress3. Dog, overdreven produktion af melanin forårsager dermatologiske problemer.
Mængden og kvaliteten af melanin i huden og iris er de vigtigste determinanter for farven på iris og hud. Enkeltpersoner kan have forskellige hud farvepræferencer; nogle fordel garvet hud, mens andre favor lysere hudfarver. Afhængigt af disse forbruger profiler, er hypopigmentering kosmetik blevet udviklet for at opfylde individuelle markeder for begunstiget hud farver4. Derfor er undersøgelser af hypopigmentering og anti-melanogenic aktivitet vigtigt både videnskabeligt og praktisk.
Melanogenesis er en kompleks proces af melanin biosyntesen gennem en serie af enzymatiske og spontane kemiske reaktioner i melanocytter. Én melanocyte er omgivet af ca 36 keratinocytter og melanocytter er melanin syntese fabrikker, som distribuerer deres produkt til tilstødende keratinocytter. I huden transporteres melanin produceret og gemt i melanosomal rum af melanocytter til tilstødende keratinocytter i epidermis via dendritter.
L-tyrosin tjener som den oprindelige substrat for melanogenesis og enzymet tyrosinase katalyserer to på hinanden følgende reaktioner, der konverterer L-tyrosin i 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og derefter ind i dopaquinone. Disse reaktioner er det hastighedsbegrænsende trin i melanogenesis5,6. Hypopigmentering aktivitet kan derfor først måles ved vurdering af cellulære tyrosinase aktivitet direkte. For at gøre det, melanocyte ekstrakter som indeholder tyrosinase inkuberes med DOPA og dopaquinone produceret i prøverne kan måles ved spektrofotometri på 475 nm. Værdierne er normaliseret af protein koncentrationer af prøver og stoffer med hypopigmentering aktivitet resulterer i mindre dopaquinone dannelse sammenlignet med kontrol.
For det andet, hypopigmentering aktivitet kan kvantificeres ved direkte måling af melanin i kulturperler melanocytter. Efter behandling af celler med teststoffet, melanin er udvundet alkalisk betingelser og melanin indhold er kvantificeret ved spektrofotometri på 400 nm. En hypopigmentering agent vil resultere i en lavere melanin indhold end kontrol7.
Endelig, hypopigmentering aktivitet kan kvantificeres ved Fontana-Masson melanin farvning og efterfølgende billedanalyse. I Fontana-Masson farvning, melanin granulat reducerer ammoniak-sølv nitrat til en synlig sort metallic tilstand og de sorte områder af celler i mikroskopiske billeder repræsenterer mængden af melanin.
En hypopigmentering agent giver normalt sammenhængende og sammenlignelige resultater med disse tre metoder, som bekræfter, at aktiviteten af stoffet er gyldig. Alternativt kan det være nyttigt at måle udtryk for centrale gener og proteiner i melanogenesis svar på en test-kemikaliet at undersøge hypopigmentering aktivitet. Tyrosinase er tyrosinase-relaterede proteiner (TRP-1) og dopachrome tautomerase (TRP-2) kritiske enzymer i melanogenesis8. Transskription faktor microphthalmia-associerede transskription faktor (MITF) er en master regulator i melanogenesis og kvantificering af dens gen/protein udtryk niveauer eller en promotor aktivitet assay kan også bruges til at vurdere hypopigmentering aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterede protokoller for at vurdere hypopigmentering aktiviteten af test forbindelser ved hjælp af kulturperler melanocytter. De repræsentative resultater viste hypopigmentering effekt af arbutin, en tyrosinase hæmmer, der hæmmede tyrosinase aktivitet og cellulære melanin indhold. Disse metoder er meget udbredt i anti-melanogenic aktivitet forskning. Bruger disse assays, vi har også med succes identificeret flere bioaktive stoffer, der har melanogenesis hæmmende effekter på B16F10 celler i sidste ti år<s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Korea Institut for planlægning og evaluering for teknologi inden for fødevarer, landbrug og skovbrug (IPET) gennem programmet Agri-bioindustrien teknologi udvikling, finansieret af Ministeriet for landbrug, fødevarer og landdistrikter anliggender (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) og skole af biovidenskab og bioteknologi i BK21 PLUS, Korea Universitet.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
Riferimenti
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F. Melanin chemistry and the ecology of stress. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents – existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D’Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. Signaling pathways in melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
