Saccharomyces cerevisiae حركية النمو الهائل في الثقافة دفعة تحليل الأيض معفن والجهاز التنفسي
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتقدير الأيض معفن والجهاز التنفسي باحتواء النمو الأسى ل Saccharomyces cerevisiae لمعادلة النمو المتسارع. يسمح حساب المعلمات الحركية لفحص تأثيرات المواد/المركبات على التخمر أو التنفس المتقدرية.
Abstract
الخلايا saccharomyces cerevisiae في المرحلة الأسية مواصلة نموها بإنتاج ATP عن طريق التخمير و/أو التنفس المتقدرية. أن تركيز الكربون تخمر أساسا يحكم كيفية توليد خلايا الخميرة ATP؛ وهكذا، يدفع التباين في مستويات تخمر الكربوهيدرات الأيض نشطة من S. cerevisiae. وتصف هذه الورقة أسلوب الفائق يقوم على نمو الخميرة الأسية لتقدير الآثار المترتبة على التغييرات تركيز وطبيعة مصدر الكربون في الأيض معفن والجهاز التنفسي. نمو S. cerevisiae يقاس صفيحة أو اهتزت المخروطية قارورة بواسطة تحديد الكثافة البصرية (OD) 600 نانومتر. ثم، هو بناها منحنى نمو OD رسم مقابل الوقت، مما يسمح بتحديد واختيار المرحلة الأسية، ومزودة بمعادلة النمو الأسى للحصول على معلمات الحركية. عموما تمثل معدلات نمو منخفضة محددة بإضعاف مضاعفة أعلى نمو الجهاز تنفسي. على العكس من ذلك، تشير معدلات نمو محددة مع انخفاض مرات مضاعفة النمو معفن. تقدر قيم العتبة لمضاعفة الوقت ومعدل نمو محددة باستخدام شروط الجهاز التنفسي أو معفن المعروفة جيدا، مثل مصادر الكربون غير تخمر أو تركيزات أعلى من تخمر السكريات. يتم الحصول على هذه لكل سلالة معينة. أخيرا، تتم مقارنة المعلمات الحركية المحسوبة بقيم العتبة تحديد ما إذا كانت الخميرة يظهر النمو معفن و/أو الجهاز التنفسي. وميزة هذا الأسلوب هو بساطتها النسبية لفهم آثار مادة/مجمع على الأيض معفن أو الجهاز التنفسي. من المهم تسليط الضوء على أن النمو عملية بيولوجية معقدة ومعقدة؛ ولذلك، البيانات الأولية من هذا الأسلوب يجب أن تؤكده التحديد الكمي لاستهلاك الأوكسجين وتراكم مشتقات التخمير. وبالتالي، يمكن استخدام هذا الأسلوب كفرز أولى للمركبات/المواد التي قد تخل أو تعزيز الأيض معفن أو الجهاز التنفسي.
Introduction
النمو saccharomyces cerevisiae بمثابة أداة قيمة تحديد عشرات الآليات الفيزيولوجية والجزيئية. ويقاس النمو أساسا بثلاث طرق: تخفيف المسلسل لاختبار البقعة، ووحدة تشكيل مستعمرة العد، ومنحنيات النمو. يمكن استخدام هذه التقنيات وحدها أو في تركيبة مع مجموعة متنوعة من ركائز والظروف البيئية، وطفرات والمواد الكيميائية للتحقيق في استجابات محددة أو تعمل.
التنفس المتقدرية هو عملية بيولوجية فيها حركية النمو وقد طبقت بنجاح لاكتشاف آليات غير معروفة. وفي هذه الحالة، مصادر مكملات وسائط النمو مع الكربون غير تخمر مثل الجلسرين أو لاكتات الإيثانول (التي يستقلبان حصرا بالتنفس المتقدرية)، كما يسمح للكربون والطاقة هو المصدر الوحيد لتقييم نمو الجهاز التنفسي، هو أمر مهم للكشف عن اضطرابات في الفسفرة النشاط1. من ناحية أخرى، أنها معقدة استخدام نماذج النمو الحركية كطريقة لفك رموز الآليات وراء التخمير.
دراسة التخمر والتنفس المتقدرية ضروري لتوضيح الآليات الجزيئية وراء بعض تعمل مثل كرابتري وواربورغ2،الآثار3. أثر كرابتري يتسم بزيادة قدرها glycolytic التمويه، القمع للتنفس المتقدرية، وإنشاء للتخمير كالمسار الأساسي لتوليد ATP وجود تركيزات عالية من الكربوهيدرات تخمر (> 4،0.8 ملم)5. أثر واربورغ أيضي تمثيلي لأثر كرابتري، مع الفرق أن في خلايا الثدييات، هو المنتج الرئيسي للتخمير لاكتات6. وفي الواقع، معروض أثر واربورغ بمجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية، تسبب امتصاص الجلوكوز والاستهلاك حتى في وجود الأكسجين7. وبالتالي، دراسة الأساس الجزيئي للتبديل من التنفس للتخمير في أثر كرابتري قد آثار التكنولوجيا الحيوية (لإنتاج الإيثانول) والآثار المحتملة في أبحاث السرطان.
قد يكون النمو S. cerevisiae أداة مناسبة لدراسة آثار كرابتري وواربورغ. هذه الفكرة تستند إلى حقيقة أن مرحلة الأسى الخميرة، هي مسارات المركزية المستخدمة لإنتاج ATP التنفس المتقدرية والتخمير، وضرورية للحفاظ على النمو. على سبيل المثال، نمو S. cerevisiae اتصالاً وثيقا بوظيفة سبل توليد ATP. في S. cerevisiae، ATP تنتج قرابة 18 التنفس المتقدرية جزيئات كل جزيء الجلوكوز، بينما يولد التخمير فقط 2 جزيئات ATP، ومن ثم يتوقع أن معدل النمو قد ضيق الروابط مع المسارات الأيضية إنتاج ATP8. وفي هذا الصدد، عند التخمير هو الطريق الرئيسي لتوليد ATP، يعوض الخميرة لإنتاج ATP منخفضة عن طريق زيادة معدل امتصاص الجلوكوز. على العكس من ذلك، منخفض استهلاك الجلوكوز خلايا الخميرة التي تستخدم التنفس المتقدرية ATP المصدر الرئيسي. يشير هذا إلى أن من المهم للخميرة إلى توافر الكربوهيدرات الشعور قبل تحديد كيف سيتم إنشاء ATP. ولذلك، توافر الجلوكوز دوراً هاما في التبديل بين التخمير والتنفس المتقدرية في cerevisiae س. وجود كميات كبيرة من السكر، يفضل الخميرة التخمير كالتوجيه المركزي لتوليد ATP. من المثير للاهتمام، عندما يتم تخمر الخميرة، هو الحفاظ على معدل نمو محددة إلى الحد الأقصى. من ناحية أخرى، ضمن مستويات منخفضة من الجلوكوز ينتج S. cerevisiae ATP باستخدام التنفس المتقدرية، الحفاظ على انخفاض معدلات النمو. وبالتالي، التباين في التركيز الجلوكوز واستخدام مصادر الكربون الأخرى تحدث تغييرات في تفضيل للخميرة بين النمو معفن والجهاز التنفسي. تأخذ في الاعتبار هذه الحقيقة مع معادلة النمو الأسى، يمكنك الحصول على معنى البيولوجية لمعلمات الحركية مثل مضاعفة الوقت (Dt) ومعدل النمو المحددة (μ). على سبيل المثال، تم العثور على قيم μ أقل عندما يستخدم الخميرة التنفس المتقدرية كالمسار الأساسي. على العكس من ذلك، عثر على ظروف لصالح التخمير، قيم μ أعلى. يمكن استخدام هذه المنهجية لقياس الآليات المحتملة لأي من المواد الكيميائية التي تؤثر على التخمر والتنفس المتقدرية في cerevisiae س.
والهدف من هذه الورقة أن يقترح أسلوب يقوم على حركية النمو لفحص آثار مادة/مركب معين على التنفس المتقدرية أو التخمير.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد مر وقت طويل J. مونو10 وأعرب عن أن دراسة نمو الثقافات البكتيرية هي الطريقة الأساسية لعلم الأحياء المجهرية. تأخير ظهور الأدوات الجزيئية في الاستخدام ودراسة النمو كأسلوب. وعلى الرغم من الطابع المعقد للنمو الذي ينطوي على العديد من العمليات المترابطة، يمكن وصف آلياتها الأساسية…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أيد هذا المشروع بمنح y Consejo ناسيونال دي العلوم التكنولوجيا (رقم المنحة 293940) ومؤسسة تيلمكس-TELCEL (رقم المنحة 162005585)، على حد سواء ليضرب.
Materials
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
Riferimenti
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?. Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
