שמר האפייה קינטיקה גידול אקספוננציאלי בתרבות אצווה כדי לנתח את חילוף החומרים הנשימה ואת Fermentative

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את חילוף החומרים בדרכי הנשימה, fermentative על-ידי התאמת הגידול האקספוננציאלי של האפייה למשוואה צמיחה אקספוננציאלית. חישוב הפרמטרים קינטי מאפשר להקרנה של השפעות של חומרים/תרכובות תסיסה או מיטוכונדריאלי נשימה.

Abstract

שמר האפייה תאים בשלב מעריכי לקיים את הצמיחה שלהם על-ידי הפקת ATP באמצעות תסיסה ו/או מיטוכונדריאלי נשימה. ריכוז פחמן בהתססה של מושל בעיקר איך תאי השמרים מייצרים ATP; לפיכך, הוריאציה ברמות פחמימות בהתססה של כוננים חילוף החומרים האנרגטי של cerevisiae ס. מאמר זה מתאר שיטה תפוקה גבוהה המבוססת על צמיחת שמרים מעריכי כדי להעריך את ההשפעות של שינויי ריכוז והטבע של מקור פחמן על חילוף החומרים הנשימה ואת fermentative. הצמיחה של cerevisiae נמדד microplate או מנוער חרוט הבקבוק על-ידי קביעת הצפיפות האופטית (OD)-600 ננומטר. לאחר מכן, עקומת גדילה זה נבנה על ידי OD ההתוויה נגד הזמן, אשר מאפשרת זיהוי ובחירה של שלב מעריכית, והוא מצויד עם המשוואה הגידול האקספוננציאלי לקבל פרמטרים קינטי. שיעורי צמיחה ספציפיים נמוך עם גבוה יותר פעמים ההכפלה בדרך כלל מייצגים גידול בדרכי הנשימה. לעומת זאת, שיעור צמיחה ספציפיים גבוה עם התחתון פעמים ההכפלה מצביעים על צמיחה fermentative. ערכי הסף של הכפלת זמן ושיעור צמיחה ספציפיים מוערך באמצעות מחלות בדרכי הנשימה או fermentative ידועים, כמו פחמן בהתססה של מקורות או ריכוז גבוה של סוכרים בהתססה. זה מתקבל עבור כל זן ספציפי. לבסוף, הפרמטרים קינטי מחושב מושווים עם ערכי סף כדי לקבוע אם השמרים מציגה צמיחה fermentative ו/או בדרכי הנשימה. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות היחסית להבנת השפעת תרכובת/חומר על חילוף החומרים fermentative או בדרכי הנשימה. חשוב להדגיש כי הצמיחה היא תהליך ביולוגי מסובכים ומורכבים; לכן, המידע הראשוני של שיטה זו חייבת להיות שחלקית כימות של צריכת החמצן והצטברות תוצרי לוואי תסיסה. ובכך, טכניקה זו יכולה לשמש הקרנה ראשוני של תרכובות/חומרים אשר עשויים להפריע או לשפר את חילוף החומרים fermentative או בדרכי הנשימה.

Introduction

שמר האפייה צמיחה שימש כלי חשוב כדי לזהות עשרות מנגנונים פיזיולוגיים ומולקולרית. צמיחה נמדד בעיקר על ידי שלוש שיטות: טורי דילולים בדיקות ספוט, המושבה יוצרי יחידת ספירה של עקומות גדילה. שיטות אלה ניתן להשתמש לבד או בשילוב עם מגוון רחב של סובסטרטים, תנאים סביבתיים, מוטציות, כימיקלים לחקור תגובות ספציפיות או פנוטיפים.

נשימה מיטוכונדריאלי היא תהליך ביולוגי שבו קינטיקה גידול יושם בהצלחה על גילוי מנגנוני לא ידוע. במקרה זה, תוספת של צמיחה מדיה עם פחמן בהתססה של מקורות כגון גליצרול, לקטאט או אתנול (אשר הם מטבוליזם באופן בלעדי על ידי נשימה מיטוכונדריאלי), כמו המקור פחמן ואנרגיה הבלעדי מאפשר להעריך הצמיחה בדרכי הנשימה, וזה חשוב. לזהות לפליטת זרחון חמצוני פעילות¹. מצד שני, זה מסובך להשתמש גידול קינטית מודלים כשיטה עבור פיענוח המנגנון מאחורי תסיסה.

המחקר של תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי חיונית כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים מאחורי פנוטיפים מסוימים כגון קרבטרי, ורבורג אפקטים^2,3. האפקט קרבטרי מאופיין על ידי גידול של שטף glycolytic, דיכוי של הנשימה מיטוכונדריאלי, ואת הקמתה של תסיסה כנתיב העיקרי ליצירת ATP בנוכחות ריכוזים גבוהים של בהתססה של פחמימות (> ^4,0.8 מ מ)⁵. ורבורג הוא אנלוגי סמויה על אפקט קרבטרי, כאשר ההבדל בכך בתרבית של תאים, המוצר העיקרי של תסיסה הוא לקטט⁶. אכן, ורבורג מוצגת על ידי מגוון של תאים סרטניים, מפעילה ספיגת הגלוקוז וצריכת אפילו בנוכחות חמצן⁷. ובכך, ללמוד את הבסיס המולקולרי של המתג של נשימה כדי תסיסה האפקט קרבטרי יש גם השלכות ביוטכנולוגי (לייצור אתנול) וגם השפעות אפשריות בחקר הסרטן.

Cerevisiae ס הצמיחה עשויה להיות כלי מתאים כדי לחקור את ההשפעות קרבטרי, ורבורג. הרעיון זה מבוסס על העובדה כי בשלב מעריכי שמרים, משעולים המרכזי שימוש להפקת ATP הם נשימה מיטוכונדריאלי, תסיסה, המהווה מרכיב חיוני כדי לקיים את הצמיחה. למשל, הצמיחה של cerevisiae בצורה אינטימית קשורה הפונקציה של מסלולים ליצירת ATP. במולקולות cerevisiae ס, מ- ATP מייצרת כ 18 מיטוכונדריאלי נשימה לכל מולקולת גלוקוז, ואילו תסיסה יחולל רק 2 מולקולות ATP, ומכאן הוא צפוי כי קצב הגידול יש קישורים הדוקים עם משעולים חילוף החומרים הפקת ATP⁸. בהקשר זה, כאשר המסלול העיקרי ליצירת ATP תסיסה, השמרים מפצה על ייצור ATP נמוכה על-ידי הגברת קצב ספיגת הגלוקוז. להפך, צריכת הסוכר על ידי תאי שמרים להשתמש נשימה מיטוכונדריאלי כמקור ATP העיקרי הוא נמוך. אפשרות זו מציינת כי חשוב עבור השמרים ל הגיוני פחמימות זמינות לפני קביעת איך ייווצר ATP. לכן, זמינות גלוקוז ממלא תפקיד חשוב ב הבורר בין תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי ב cerevisiae ס. בנוכחות כמויות גבוהות של גלוקוז, מעדיף השמרים תסיסה כמו הנתיב המרכזי ליצירת ATP. מעניין, השמרים הוא החימוץ, קצב הגידול הספציפי נשמר מקסימום שלה. מצד שני, תחת רמות נמוכות של גלוקוז, cerevisiae ס מייצרת ATP באמצעות נשימה מיטוכונדריאלי, שמירה על שיעורי הצמיחה נמוכה. ובכך, וריאציה בריכוז של גלוקוז ושימוש של מקורות פחמן אחרים לגרום שינויים בהעדפות של השמרים בין צמיחה fermentative, מערכת הנשימה. מאת לוקח בחשבון את העובדה הזו עם המשוואה גידול אקספוננציאלי, הוא יכול להשיג את המשמעות הביולוגית של קינטי פרמטרים כגון הכפלת זמן (Dt) ושיעור צמיחה ספציפיים (ממוצע). לדוגמה, ערכים נמוכים יותר ממוצע נמצאו כאשר השמרים משתמש נשימה מיטוכונדריאלי כנתיב העיקרי. להפך, בתנאים טובה תסיסה, נמצאו ערכים ממוצע גבוהים יותר. מתודולוגיה זו עשוי לשמש כדי למדוד את המנגנונים סביר של כל כימיקלים המשפיעים על תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי ב cerevisiae ס.

מטרת מאמר זה היא להציע שיטה המבוססת על צמיחה קינטיקה לסינון את ההשפעות של תרכובת/חומר נתון על נשימה מיטוכונדריאלי או תסיסה.

Protocol

1. תרבות המדיה והכנות Inoculum להכין 100 מ של 2% תמצית-peptone-dextrose (YPD) שמרים בינוני נוזלי (להוסיף תמצית 1 גר’ שמרים, 2 גר’ קזאין peptone, ו- 2 גר’ גלוקוז ל 100 מ של מים מזוקקים). לוותר על 3 מ”ל של המדיה לתוך צינורות חרוט sterilizable 15 mL. אוטוקלב התקשורת למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ו 1.5 psi.הערה: המדיה ניתן לאחסן עד ?…

Representative Results

עקומות גדילה יכול לשמש preliminarily להפלות בין פנוטיפים הנשימה ו fermentative ב ס cerevisiae השמרים. לכן, ביצענו תרבויות אצווה של cerevisiae ס (BY4742) עם ריכוזי גלוקוז שונים דווח כי כדי לגרום לצמיחה fermentative: 1%, 2% ו- 10% (w/v)9. תרבויות מציג הפנוטיפ fermentative שלב פיגור קטן ויש שלב מערי…

Discussion

זמן רב עבר מאז ומונו ג’¹⁰ הביעו כי המחקר של הצמיחה של חיידקים תרבויות היא השיטה הבסיסית של מיקרוביולוגיה. כניסתו של הכלים מולקולרית מעכב את השימוש והלימוד של הגידול כמו טכניקה. למרות המורכבות של צמיחה אשר מערבת תהליכים לתקצב רבים, מנגנוני הבסיסית שלה יכולה להיות מתוארת באמצעות…

Materials

Orbital Shaker	Thermo Scientific	4353	For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen	Growth curves	C MBR	For batch cultures in microplates
Glucose	Sigma	G7021	For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest	Sigma	82303	For YPD broth preparation
Yeast extract	Sigma	09182-1KG-F	For YPD broth preparation
Bacteriological Agar	Sigma	A5306	For YPD agar preparation
NaH2PO4	Sigma	S8282	For SC broth preparation
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate	Sigma	Y1251	For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements	Sigma	Y1501	For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular	J.T. Baker	0792-R	For medium supplementation example
Resveratrol	Sigma	R5010	For medium supplementation example
Galactose	Sigma	G8270	For medium supplementation example
Sucrose	Sigma	S7903	For medium supplementation example
Absolut ethanol	Merck	107017	For medium supplementation example
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	For medium supplementation example
GraphPad Prism	GraphPad Software		For data analysis
Honeycomb microplates	Thermo Scientific	9502550	For microplate cultures