Saccharomyces cerevisiae Cinética de crecimiento exponencial en la cultura de lote para analizar el metabolismo respiratorio y fermentativo
Summary
Aquí presentamos un protocolo para estimar el metabolismo respiratorio y fermentativo encajando el exponencial crecimiento de Saccharomyces cerevisiae a la ecuación de crecimiento exponencial. Cálculo de los parámetros cinéticos permite la proyección de la influencia de compuestos de sustancias en fermentación o respiración mitocondrial.
Abstract
Las células de Saccharomyces cerevisiae en la fase exponencial sostienen su crecimiento mediante la producción de ATP por fermentación o respiración mitocondrial. La concentración de carbono fermentables principalmente gobierna cómo las células de levadura generan ATP; por lo tanto, la variación en los niveles de carbohidratos fermentables impulsa el metabolismo energético de S. cerevisiae. Este papel describe un método de alto rendimiento basado en el crecimiento exponencial de la levadura para estimar los efectos de los cambios de la concentración y naturaleza de la fuente de carbono sobre el metabolismo respiratorio y fermentativo. El crecimiento de S. cerevisiae es medido en una microplaca o sacudirse cónico matraz mediante la determinación de la densidad óptica (OD) a 600 nm. Entonces, una curva de crecimiento es construida por OD trazado frente al tiempo, que permite la identificación y selección de la fase exponencial y está equipado con la ecuación de crecimiento exponencial para obtener parámetros cinéticos. Las tasas de crecimiento bajo con tiempos de duplicación superiores generalmente representan un crecimiento respiratorio. Por el contrario, mayores tasas de crecimiento específico con menores tiempos de duplicación indican crecimiento fermentativo. Valores umbral de duplicar el tiempo y la tasa de crecimiento específico se calculan usando condiciones respiratorias o fermentativas bien conocidas, tales como fuentes de carbono no fermentables o altas concentraciones de azúcares fermentables. Esto se obtiene de cada cepa específica. Por último, los parámetros cinéticos calculados se comparan con los valores de umbral para establecer si la levadura demuestra crecimiento fermentativo o respiratorio. La ventaja de este método es su relativa sencillez para la comprensión de los efectos de un compuesto de sustancia en el metabolismo fermentativo o respiratorio. Es importante destacar que el crecimiento es un proceso intrincado y complejo biológico; por lo tanto, los datos preliminares de este método deben ser corroborados por la cuantificación del consumo de oxígeno y la acumulación de subproductos de la fermentación. Por lo tanto, esta técnica puede utilizarse como una proyección preliminar de compuestos/sustancias que pueden alterar o mejorar el metabolismo fermentativo o respiratorio.
Introduction
Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae ha servido como una herramienta valiosa para identificar decenas de mecanismos fisiológicos y moleculares. Crecimiento se mide principalmente por tres métodos: diluciones seriadas para pruebas de punto, unidad formadora de colonias contando y las curvas de crecimiento. Estas técnicas se pueden utilizar solo o en combinación con una variedad de sustratos, condiciones ambientales, mutantes y productos químicos para investigar las respuestas específicas o fenotipos.
La respiración mitocondrial es un proceso biológico en el cual cinética de crecimiento se ha aplicado con éxito para descubrir mecanismos desconocidos. En este caso, la suplementación del medio de crecimiento con carbono no fermentables fuentes tales como el glicerol, el lactato o el etanol (que se metabolizan exclusivamente por la respiración mitocondrial), como la única fuente de carbono y energía permite evaluar la crecimiento respiratorio, que es importante detectar las perturbaciones en la fosforilación oxidativa actividad1. Por otro lado, es complicado usar modelos cinéticos de crecimiento como un método para descifrar los mecanismos detrás de la fermentación.
El estudio de la fermentación y la respiración mitocondrial es fundamental para dilucidar los mecanismos moleculares detrás de ciertos fenotipos como el Crabtree y Warburg efectos2,3. El efecto Crabtree se caracteriza por un aumento del flujo glicolítico, la represión de la respiración mitocondrial y el establecimiento de la fermentación como la vía primaria para generar ATP en presencia de altas concentraciones de carbohidratos fermentables (> 0,8 mM)4,5. El efecto de Warburg es metabólicamente análogo al efecto Crabtree, con la diferencia que en células de mamíferos, el principal producto de la fermentación es lactato6. De hecho, el efecto de Warburg es exhibido por una variedad de células cancerosas, provocando la absorción de glucosa y consumo incluso en presencia de oxígeno7. De tal modo, estudiando la base molecular de la cambio de respiración a la fermentación en el efecto Crabtree tiene repercusiones biotecnología (producción de etanol) e impactos potenciales en la investigación del cáncer.
Crecimiento de S. cerevisiae puede ser una herramienta adecuada para estudiar los efectos de Crabtree y Warburg. Esta idea es basa en el hecho de que en la fase exponencial de la levadura, las vías central utilizadas para producir ATP son la respiración mitocondrial y la fermentación, que son esenciales para sostener el crecimiento. Por ejemplo, el crecimiento de S. cerevisiae está íntimamente relacionada con la función de las vías generadoras de ATP. En moléculas de S. cerevisiae, la respiración mitocondrial produce aproximadamente 18 ATP por molécula de glucosa, mientras que la fermentación sólo genera 2 moléculas de ATP, por lo tanto, se espera que la tasa de crecimiento tiene estrecha vínculos con las vías metabólicas la producción de ATP8. En este sentido, cuando la fermentación es la ruta principal para generar ATP, la levadura compensa la baja producción de ATP mediante el aumento de la tasa de absorción de la glucosa. Por el contrario, el consumo de glucosa por las células de levadura que utilizan la respiración mitocondrial como la principal fuente de ATP es bajo. Esto indica que es importante que la levadura a la disponibilidad de hidratos de carbono de sentido antes de determinar cómo se genera ATP. Por lo tanto, la disponibilidad de la glucosa desempeña un papel importante en el interruptor entre fermentación y respiración mitocondrial en S. cerevisiae. En presencia de altas cantidades de glucosa, la levadura prefiere la fermentación como la ruta central para generar ATP. Curiosamente, cuando la fermentación de la levadura, la tasa de crecimiento se mantiene en su máximo. Por otra parte, bajo niveles bajos de glucosa, S. cerevisiae produce ATP utilizando la respiración mitocondrial, manteniendo tasas de crecimiento. Por lo tanto, variación en la concentración de la glucosa y el uso de otras fuentes de carbono inducir cambios en la preferencia de la levadura entre el crecimiento fermentativo y respiratorio. Teniendo en cuenta este hecho con la ecuación de crecimiento exponencial, se puede obtener el significado biológico de parámetros cinéticos como la duplicación de tiempo (Dt) y tasa de crecimiento específico (μ). Por ejemplo, se encontraron menores valores de μ cuando la levadura utiliza la respiración mitocondrial como la vía principal. Por el contrario, bajo condiciones que favorecen la fermentación, se encontraron valores más altos de μ . Esta metodología puede utilizarse para medir los probables mecanismos de sustancias químicas que afectan a la fermentación y la respiración mitocondrial en S. cerevisiae.
El objetivo de este trabajo es proponer un método basado en la cinética de crecimiento para la detección de los efectos de un determinada sustancia/compuesto sobre la respiración mitocondrial o fermentación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mucho tiempo ha pasado desde que J. Monod10 expresa que el estudio del crecimiento de cultivos bacterianos es el método básico de la microbiología. El advenimiento de las herramientas moleculares retrasa el uso y el estudio del crecimiento como una técnica. A pesar de la complejidad de crecimiento que involucra numerosos procesos relacionados entre sí, sus mecanismos subyacentes pueden describirse mediante el uso de modelos matemáticos11. Se trata de un enfoque robust…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (número 293940) y Fundación TELMEX-TELCEL (número 162005585), ambos a IKOM.
Materials
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
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