जीनोम संपादन द्वारा Drosophila में ऊतक विशिष्ट द्विआधारी प्रतिलेखन प्रणाली पैदा करने के लिए एक कुशल रणनीति
Summary
यहां, हम प्रतिलेखन ड्राइवरों के साथ जीन की पहली कोडिंग एक्सॉन की जगह द्वारा Drosophila में ऊतक विशिष्ट द्विआधारी प्रतिलेखन प्रणाली पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । CRISPR/Cas9-आधारित विधि एक जगह जीन के अंतर्जात विनियमन के तहत एक transactivator अनुक्रम रखता है, और फलस्वरूप जीन विशेष transctivator पैटर्न में विशेष रूप से spatiotemporal अभिव्यक्ति की सुविधा ।
Abstract
द्विआधारी प्रतिलेखन प्रणाली शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण व्यापक रूप से visualizing और सेल भाग्य और कोशिकाओं या मॉडल जीवों में ऊतकों के विशिष्ट समूहों में जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । इन सिस्टमों में अलग ट्रांसजेनिक रेखाओं के रूप में दो घटक होते हैं । एक चालक लाइन ऊतक के नियंत्रण के तहत एक transcriptional उत्प्रेरक-विशिष्ट प्रवर्तक/बढ़ाने, और एक रिपोर्टर/प्रभाव लाइन एक लक्ष्य जीन प्रतिलेखन उत्प्रेरक के बंधन साइट के लिए बहाव रखा बंदरगाह । पशु दोनों घटकों को शरण एक लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति की ऊतक विशिष्ट transactivation प्रेरित । लक्षित ऊतकों में जीन की सटीक spatiotemporal अभिव्यक्ति कोशिका की निष्पक्ष व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है/ इसलिए, विशेष सेल/ऊतक-विशिष्ट ड्राइवर लाइनों पैदा करने के लिए एक विधि का विकास आवश्यक है । यहां हम एक विधि एक “नियमित रूप से अंतरालीय लघु Palindromic दोहराने/CRISPR-एसोसिएटेड” (CRISPR/Cas) आधारित जीनोम संपादन तकनीक को रोजगार द्वारा अत्यधिक ऊतक विशिष्ट लक्षित अभिव्यक्ति प्रणाली उत्पंन करने के लिए एक तरीका प्रस्तुत करते हैं । इस विधि में, endonuclease Cas9 डबल-कतरा टूटता (gRNA) बनाने के लिए एक्सॉन जीनोम में एक जीन की पहली कोडिंग Drosophila में विशिष्ट साइटों के लिए दो chimeric गाइड RNAs (DSB) द्वारा लक्षित है । बाद में, transactivator अनुक्रम युक्त एक exogenous दाता प्लाज्मिड का उपयोग करते हुए, कोशिका-स्वायत्त मरंमत मशीनरी DSB के समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR) को सक्षम करती है, जिसके परिणामस्वरूप एक्सॉन के साथ सटीक विलोपन और प्रतिस्थापन होता है transactivator अनुक्रम. खटखटाया-transactivator में विशेष रूप से कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जहां सीआईएसप्रतिस्थापित जीन के नियामक तत्वों कार्यात्मक हैं । विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत एक द्विआधारी transcriptional ड्राइवर पैदा करने के लिए Drosophila fgfमें व्यक्त/branched-उत्पादक उपकला/न्यूरॉन कोशिकाओं किसी भी जीन या ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए अपनाया जा सकता है ।
Introduction
लक्षित जीन अभिव्यक्ति के लिए आनुवंशिक toolbox अच्छी तरह से Drosophilaमें विकसित किया गया है, यह सबसे अच्छा मॉडल प्रणालियों में से एक के लिए सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता में शामिल जीन के समारोह की जांच कर रही है । द्विआधारी अभिव्यक्ति सिस्टम, जैसे खमीर Gal4/यूएएस (ऊपर सक्रियकरण अनुक्रम), पहले ऊतक विशेष बढ़ाने फँसाने और Drosophila आनुवंशिक मॉडल1 (चित्रा 1) में जीन अर्थ के लिए अपनाया गया था । यह प्रणाली ऐसी जीन व्यक्त की spatiotemporal विनियमन के रूप में तकनीक की एक बड़ी संख्या के विकास की सुविधा, व्यक्त, कोशिकाओं के चयनित समूहों में नॉकआउट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल पृथक में, सेल अंकन, सेलुलर और आणविक के लाइव अनुरेखण भ्रूण और ऊतकों, वंश अनुरेखण और मोज़ेक विश्लेषण में विकास के दौरान प्रक्रियाओं । ऐसे बैक्टीरियल LexA/LexAसेशन प्रणाली (चित्रा 1) और Neurospora क्यू प्रणाली के रूप में द्विआधारी प्रतिलेखन प्रणाली, के एक नंबर, शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण है कि अब व्यापक रूप से Drosophila में इस्तेमाल कर रहे हैं , इसके अलावा में लक्षित जीन अभिव्यक्ति के लिए मूल Gal4/यूएएस प्रणाली1,2,3।
यहाँ, हम एक जीनोम संपादन तकनीक को रोजगार के द्वारा अत्यधिक विश्वसनीय ऊतक विशिष्ट द्विआधारी अभिव्यक्ति प्रणाली उत्पन्न करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी में हाल ही में प्रगति के लिए अभूतपूर्व जीवों की एक व्यापक रेंज में जीनोम परिवर्तन का निर्देशन करने के अवसरों की अनुमति दी है । अंय उपलब्ध जीनोम संपादन तकनीक की तुलना में, CRISPR/Cas9 प्रणाली सस्ती, कुशल, और विश्वसनीय है । इस तकनीक जीवाणु अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के घटकों का इस्तेमाल करता है: स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes की एक Cas9 endonuclease कि एक डबल-किनारा तोड़ (DSB), और एक chimeric गाइड आरएनए (gRNA) है, जो एक विशेष जीनोम साइट के लिए Cas9 गाइड बनाता है लक्षित DSB4. कोशिकाओं को विभिन्न रास्ते का उपयोग कर DSB की मरंमत करने के लिए मशीनरी होते हैं । गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) छोटे सम्मिलन या हटाने के लिए जीन समारोह को बाधित करने की ओर जाता है, जबकि समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR) एक परिभाषित निर्देशित/वांछनीय जीनोमिक नॉक-इन/दस्तक एक exogenous HDR दाता का उपयोग करके एक टेंपलेट के रूप में परिचय । HDR-आधारित प्रतिस्थापन रणनीति कुशलतापूर्वक एक अत्यधिक विश्वसनीय ऊतक-विशिष्ट बाइनरी अभिव्यक्ति प्रणाली है, जो पारंपरिक बढ़ाने जाल तरीकों की सभी सीमाओं को दूर कर सकते हैं उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । हम CRISPR/Cas9-आधारित HDR मरंमत के उपयोग के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया का वर्णन एक द्विआधारी प्रतिलेखन चालक लाइन है कि अंतर्जात transcriptional और एक transcriptional के बाद Drosophila विनियमन के नियंत्रण में व्यक्त की है पैदा करने में जीन. इस प्रोटोकॉल में, हम शाखा के लिए एक चालक लाइन (मास्टर्स) जीन एक FGF परिवार के प्रोटीन है कि सांस airway उपकला के शाखाकरण morphogenesis नियंत्रित करता है एंकोडिंग के लिए विशिष्ट की पीढ़ी का प्रदर्शन5। इस उदाहरण में, मास्टर्स जीन की पहली कोडिंग एक्सॉन अंतर्जात जीन के किसी भी मास्टर्स सीआईएस-विनियामक दृश्यों को बदलने के बिना एक जीवाणु LexA transactivator अनुक्रम के अनुक्रम द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था । हम बताते है कि रणनीति एक मास्टर्स-LexA चालक लाइन है कि spatiotemporally एक रिपोर्टर जीन LexAoperator के बहाव (LexAop या LexO) विशेष रूप से मास्टर्स में रखा की अभिव्यक्ति नियंत्रण उत्पंन — उपकला/mesenchymal/न्यूरॉन कोशिकाओं को व्यक्त.
Protocol
Representative Results
Discussion
परंपरागत रूप से, Drosophila बढ़ाने जाल दो अलग तरीकों से उत्पंन किया गया । तरीकों में से एक स्थानांतरण (जैसे, पी तत्व स्थानांतरण)1 द्वारा जीनोम में एक ड्राइवर (eg., Gal4) अनुक्रम के यादृच्छिक प्रविष…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम dr. F पोर्ट, dr. K. कॉनर-Giles, और डॉ एस फेंग CRISPR रणनीति पर विचार विमर्श के लिए धंयवाद; Dr. T.B. Kornberg, और ब्लूमिंगटन स्टॉक सेंटर के लिए रिएजेंट; UMD इमेजिंग कोर सुविधा; और NIH से फंडिंग: R00HL114867 और R35GM124878 से सीनियर
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Biologia Molecolare |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Biologia Molecolare |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Biologia Molecolare |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Biologia Molecolare |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Biologia Molecolare |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Biologia Molecolare |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Biologia Molecolare |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Biologia Molecolare |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Biologia Molecolare |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Biologia Molecolare |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Biologia Molecolare | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Biologia Molecolare |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Biologia Molecolare |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
Riferimenti
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