Aqui, apresentamos um método para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila , substituindo o primeiro exon codificação de genes com drivers de transcrição. O método baseado em CRISPR/Cas9 coloca uma sequência liberada sob o Regulamento endógena de um gene substituído e, consequentemente, facilita a expressão de transctivator exclusivamente em padrões spatiotemporal gene-específico.
Sistemas de transcrição binário são poderosas ferramentas de genéticas, amplamente utilizadas para visualizar e manipular a célula destino e gene expression em grupos específicos de células ou tecidos em organismos-modelo. Estes sistemas contêm duas componentes linhas transgénicas. Uma linha de motorista expressa um ativador transcricional sob o controle de promotores/potenciadores de tecido-específica e uma linha de repórter/efetoras portos um gene alvo colocado a jusante para o sítio de ligação do ativador da transcrição. Animais, abrigando os dois componentes induzem transactivation tecido-específica de uma expressão de gene alvo. Preciso spatiotemporal expressão do gene nos tecidos alvo é crítica para interpretação imparcial da atividade celular/gene. Portanto, é essencial desenvolver um método para gerar linhas de motorista exclusivo de célula/tecido-específica. Aqui nós apresentamos um método para gerar o sistema altamente específicos do tecido-alvo expressão empregando um “Clustered regularmente Interspaced curta palíndromo Repeat/CRISPR-associado” (CRISPR/Cas)-com base técnica de edição de genoma. Neste método, a endonuclease Cas9 é alvo de dois quimérico guia RNAs (gRNA) para locais específicos no primeiro exon codificação de um gene no genoma de Drosophila para criar quebras de dobro-Costa (DSB). Posteriormente, usando um plasmídeo exógena do doador que contém a sequência de liberada, a maquinaria de reparo celular-autónoma permite reparação homologia-dirigido (HDR) de ORL, resultando em preciso exclusão e substituição do exon com a liberada sequência. A batido em liberada é expressa exclusivamente nas células onde o cis-elementos reguladores do gene substituído são funcionais. O protocolo passo a passo detalhado apresentado aqui para gerar um binário driver transcriptional expressado em Drosophila fgf/branchless-produção de células epiteliais/neuronal pode ser adotado para qualquer expressão de gene – ou tecido-específica.
A caixa de ferramentas genética para a expressão do gene alvo bem desenvolveu-se em Drosophila, tornando-o um dos melhores sistemas de modelo para investigar a função de genes envolvidos em uma ampla variedade de processos celulares. Sistemas de expressão binário, como fermento Gal4/UAS (sequência de ativação upstream), foi adotado inicialmente por misexpression de trapping e gene potenciador de tecido-específica na drosófila genética modelo1 (Figura 1). Este sistema facilitou o desenvolvimento de um grande número de técnicas como spatiotemporal regulamento da superexpressão do gene, misexpression, nocaute em grupos selecionados de células, bem como em ablação de célula, marcação de célula, ao rastreamento de celular e molecular processos em embriões e tecidos, rastreamento de linhagem e análises de mosaico durante o desenvolvimento. Um número do sistema binário de transcrição, tais como o bacteriana LexA/ sistemaLexAop (Figura 1) e Q-sistema de Neurospora , são poderosas ferramentas genéticas que são amplamente utilizadas em Drosophila, além de o sistema original de Gal4/UAS para expressão de gene alvo a1,2,3.
Aqui, apresentamos um método para gerar o sistema altamente confiável tecido-específica de expressão binário empregando uma técnica de edição de genoma. Aos recentes avanços na tecnologia de edição CRISPR/Cas9 genoma permitiu oportunidades sem precedentes para fazer mudanças de direção do genoma em uma ampla gama de organismos. Em comparação com outras técnicas de edição disponíveis do genoma, o sistema CRISPR/Cas9 é barato, eficiente e confiável. Esta tecnologia utiliza componentes do sistema imune adaptativo bacteriano: uma endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes que cria uma ruptura da dobro-Costa (DSB) e um RNA guia Quimérico (gRNA), que orienta a Cas9 para um site específico do genoma para alvo de ORL4. As células contêm a maquinaria para reparar o ORL usando diferentes caminhos. Não-homóloga final juntando (NHEJ) leva a pequenas inserções ou exclusões para perturbar a função dos genes, enquanto reparo homologia-dirigido (HDR) introduz um definido dirigido/desejável genômica em/TOC-nocaute usando um doador HDR exógeno como um modelo. A estratégia de substituição baseada em HDR com eficiência pode ser utilizada para gerar um sistema altamente confiável expressão binário de tecido-específica, que pode superar todas as limitações dos métodos tradicionais potenciador armadilha. Descrevemos um procedimento passo a passo para a utilização do reparo HDR CRISPR/Cas9-baseado na geração de uma linha de driver binário da transcrição que se expressa sob o controle de endógena regulação transcricional e pós-transcricional de um da drosófila gene. Neste protocolo, demonstramos a geração de uma linha de motorista específica para branchless (bnl) gene que codifica uma proteína de família FGF que regula a morfogênese de ramificação da via aérea traqueal epitélio5. Neste exemplo, o primeiro exon codificação do gene da bnl foi substituído pela sequência de uma sequência de liberada bacteriana LexA sem alterar qualquer endógena cis-sequências reguladoras do gene do bnl . Mostramos que a estratégia gerou uma linha de motorista bnl-LexA que spatiotemporally controla a expressão de um gene repórter, colocado a jusante do LexAoperator (LexAop ou seguir) exclusivamente na bnl- expressando as células epiteliais/mesenquimais/neuronal.
Tradicionalmente, as armadilhas potenciador de Drosophila foram geradas por dois métodos diferentes. Uma das maneiras inclui inserção aleatória de um driver (eg., Gal4) sequência no genoma por transposição (EG., transposição de P-elemento)1 . Alternativamente, as sequências de motorista podem ser colocadas sob o controle transcricional de uma região de putativo realçador/promotor em uma construção do plasmídeo, que iria então ser integrada em um site de g…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos o Dr. F. Porto, Dr. K. o ‘ Connor-Giles e Dr. S. Feng para discussões sobre estratégia CRISPR; Dr. T.B. Kornberg e o centro de estoque de Bloomington para reagentes; Instalação de núcleo de imagens de UMD; e financiamento do NIH: R00HL114867 e R35GM124878 ao Sr.
X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Biologia Molecolare |
EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Biologia Molecolare |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Biologia Molecolare |
UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Biologia Molecolare |
10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Biologia Molecolare |
KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Biologia Molecolare |
EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Biologia Molecolare |
GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
Primers | IDT-DNA | PCR | |
pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Biologia Molecolare |
2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Biologia Molecolare |
Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Biologia Molecolare |
TRI reagent | Sigma-Aldrich | Biologia Molecolare | |
Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Biologia Molecolare |
OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Biologia Molecolare |
lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |