Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji
Summary
Burada, ilk kodlama exon genlerin transkripsiyon sürücüleri ile değiştirerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için bir yöntem mevcut. CRISPR/Cas9-tabanlı yöntemi bir transactivator sıra değiştirilen bir gen endojen Yönetmeliği altında yerleştirir ve sonuç olarak transctivator ifade sadece şekillerindeki gene özgü kronolojik zamanmekansal kolaylaştırır.
Abstract
İkili transkripsiyon sistemleri görselleştirme ve hücre kader ve gen ifade hücrelerin belirli gruplar veya model organizmalar içinde doku manipülasyonu için yaygın olarak kullanılan güçlü genetik araçlardır. Bu sistemlerde iki bileşeni ayrı transgenik çizgiler olarak bulunmaktadır. Bir sürücü çizgi transkripsiyon bir aktivatör doku özel Rehberleri/arttırıcılar kontrolünü ve hedef gen aşağı transkripsiyon harekete geçirmek bağlama sitesine yerleştirilen bir muhabir/efektör satır limanları altında ifade eder. Her iki bileşenin yataklık hayvan doku özgü transactivation bir hedef Gen ifadesinin neden. Kesin kronolojik zamanmekansal gen hedeflenen dokularda hücre/gen etkinliğini tarafsız yorumlanması için kritik ifadesidir. Bu nedenle, özel hücre/doku özel sürücü satırları oluşturmak için bir yöntem geliştirmek esastır. Burada istihdam ederek yüksek doku özel hedeflenmiş ifade sistemi oluşturmak için bir yöntem mevcut bir “düzenli olarak kümelenmiş Interspaced kısa palindromik tekrar/CRISPR-ilişkili” (CRISPR/CA)-Teknik düzenleme genom dayalı. Bu yöntemde, bir genin iki iplikçikli kırılmalar (DSB) oluşturmak için Drosophila genom içinde ilk kodlama exon belirli sitelere RNA’ların (gRNA) yol Cas9 chimeric iki tarafından hedeflenen endonükleaz. Daha sonra transactivator sıra içeren bir eksojen donör plazmid kullanmak, hücre özerk onarım makineleri Homoloji yönetmen onarım (HDR) kesin silme ve değiştirme exon transactivator ile sonuçlanan DSB, sağlar sıra. Knocked olarak transactivator sadece hücrelerde ifade edilir nerede CIS-eski yerine koymak gen düzenleyici elemanlarının fonksiyonel. Burada ikili bir transkripsiyon sürücü Drosophila fgfiçinde ifade oluşturmak için sunulan ayrıntılı adım adım Protokolü /branchless-epitel/nöronal hücreleri üreten kabul için herhangi bir gen veya doku özel ifade.
Introduction
Genetik toolbox için hedeflenen Gen ifadesinin de dahil çok çeşitli hücresel genlerin işlevi araştırmak için en iyi model sistemleri biri haline Drosophila, geliştirilmiştir. Maya Gal4/UAS (ters yönde harekete geçirmek sıra) gibi ikili ifade sistemleri ilk doku özgü artırıcı bindirme ve gen misexpression Drosophila genetik model1 (Şekil 1) için kabul edilmiştir. Bu sistem çok sayıda gen overexpression, misexpression, seçili grup hücreleriyle de olduğu gibi hücre ablasyon, hücre işaretleme, hücresel ve moleküler canlı izleme nakavt kronolojik zamanmekansal düzenlenmesi gibi teknikleri geliştirilmesi kolaylaştırdı embriyo ve doku, soy izleme ve mozaik analizleri geliştirme sırasında süreçleri. Bakteriyel LexAgibi ikili transkripsiyon sistemi bir dizi /LexAop sistemi (Şekil 1) ve Neurospora Q-sistem, şimdi yaygın olarak Drosophila, ek olarak kullanılan güçlü genetik Araçlar Orijinal Gal4/UAS sistemi için hedeflenen gen ifade1,2,3.
Burada, genom düzenleme tekniği istihdam ederek son derece sağlam doku özel ikili ifade sistemi oluşturmak için bir yöntem mevcut. CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisinde son gelişmeler çok çeşitli organizmalar yönlendirilmiş genom değişiklikler yapmak eşi görülmemiş fırsat sağladı. Diğer kullanılabilir genom düzenleme teknikleri için karşılaştırıldığında, CRISPR/Cas9 sistem, verimli, ucuz ve güvenilir. Bu teknoloji bakteriyel adaptif bağışıklık sisteminin bileşenleri kullanır: bir Cas9 endonükleaz iki iplikçikli mola (DSB) oluşturan Streptococcus pyogenes ve Cas9 için belirli genom sitesine kılavuzları chimeric Kılavuzu RNA (gRNA), hedeflenen DSB4. Hücreleri farklı yollar kullanarak DSB onarmak için makine içerir. Sigara homolog sonunda (NHEJ) katılmadan küçük eklemelerin veya silmelerin eksojen bir HDR donör şablon olarak kullanarak bir tanımlanmış yönetmen/arzu genomik knock-içinde/knock-out Homoloji yönetmen onarım (HDR) tanıttı iken gen işlevi, bozmaya yol açar. HDR tabanlı yedek stratejisi verimli bir şekilde geleneksel artırıcı tuzak yöntemleri tüm sınırlamalar üstesinden son derece sağlam doku özel ikili ifade sistemi oluşturmak için yararlı olabilir. Biz bir Drosophila endojen transkripsiyon ve çoğu düzenleme kontrolü altında ifade edilir bir ikili transkripsiyon sürücü çizgi oluşturma HDR CRISPR/Cas9-esaslı onarım kullanımı için adım adım bir yordam tarif gen. Bu protokol için biz göstermek için belirli bir sürücü satır nesil branchless trakeal hava yolu epitel5dallanma morfogenez düzenleyen bir FGF aile protein kodlama (bnl) Gen. Bu örnekte, bir bakteriyel LexA transactivator sıra sıra tarafından herhangi bir endojen CISdeğiştirmeden ilk kodlama exon bnl gen değiştirildi- bnl gen düzenleyici diziler. Biz strateji sadece bnl – içinde LexAoperator (LexAop veya LexO) aşağı yerleştirilen bir muhabir gen ifadesi spatiotemporally denetleyen bir bnl LexA sürücü satır oluşturulan gösterir epitel/mezenkimal/nöronal hücre ifade ediyorum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geleneksel olarak, Drosophila artırıcı tuzakları iki farklı yöntemlerle üretilen. Bir yolu bir sürücü rasgele yerleştirilmesi içerir (örneğin., Gal4) genom tarafından devralınmasına sırayla (e.g., P-eleman transpozisyonu)1 . Alternatif olarak, sürücü dizileri sonra genom3,11ektopik bir siteye entegre bir plazmid yapısında bir sözde artırıcı/organizatörü bölgesinin transkripsiyon kont…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. F. liman, Dr. K. O’Connor-Giles ve Dr. S. Feng CRISPR strateji üzerine tartışmalar için teşekkürler; Dr. T.B. Kornberg ve reaktifler Bloomington stok merkezi; UMD görüntüleme çekirdek tesis; ve NIH finansman: R00HL114867 ve R35GM124878 SR.
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Biologia Molecolare |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Biologia Molecolare |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Biologia Molecolare |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Biologia Molecolare |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Biologia Molecolare |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Biologia Molecolare |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Biologia Molecolare |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Biologia Molecolare |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Biologia Molecolare |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Biologia Molecolare |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Biologia Molecolare | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Biologia Molecolare |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Biologia Molecolare |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
Riferimenti
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lai, S. -. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Biologia dello sviluppo. 427 (1), 35-48 (2017).
- Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O’Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).
- Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), 657-664 (2013).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetica. 186 (2), 735-755 (2010).
- Lin, C. -. C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetica. 203 (4), 1613-1628 (2016).
- Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).
