Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom
Summary
Hier presenteren we een methode voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door vervanging van de eerste codering exon van genen met transcriptie stuurprogramma’s. De CRISPR/Cas9 gebaseerde methode plaatst een transactivator reeks onder de endogene regulering van een vervangen gen, en bijgevolg vergemakkelijkt transctivator expressie uitsluitend in gen-specifieke Spatio patronen.
Abstract
Binaire transcriptie systemen zijn krachtige genetische hulpmiddelen voor het visualiseren en manipuleren van cel lot en gen-expressie in specifieke groepen van cellen of weefsels in modelorganismen op grote schaal gebruikt. Deze systemen bevatten twee componenten als afzonderlijke transgene regels. Een driver regel spreekt een transcriptionele activator onder de controle van weefsel-specifieke initiatiefnemers/versterkers, en een verslaggever/effector lijn havens een target-gen stroomafwaarts geplaatst op de site van de binding van de transcriptie activator. Dieren herbergen van beide componenten induceren weefsel-specifieke transactivation van de genexpressie van een doel. Precieze Spatio uitdrukking van het gen in gerichte weefsels is essentieel voor onbevooroordeelde interpretatie van cel/gen-activiteit. Ontwikkeling van een methode voor het genereren van exclusieve cel/weefsel-specifieke stuurprogramma lijnen is daarom essentieel. Hier presenteren we een methode voor het genereren van zeer weefsel-specifieke gerichte expressie systemen door gebruik te maken een “geclusterd regelmatig Interspaced korte palindromische Repeat/CRISPR-geassocieerde” (CRISPR/Cas)-genoom bewerken techniek gebaseerd. Bij deze methode wordt de endonuclease Cas9 wordt gericht door twee chimeer gids RNAs (gRNA) voor specifieke sites in de eerste codering exon van een gen in het genoom van de Drosophila maken dubbel-strand einden (DSB). Vervolgens kan met behulp van een exogene donor plasmide met de transactivator reeks, de cel-autonome reparatie machines homologie geleide herstellen (HDR) van de DSB, wat resulteert in precieze verwijdering en vervanging van de exon met de transactivator volgorde. De transactivator klopte-in wordt uitgedrukt uitsluitend in cellen waar het cis-regelgevende elementen van het vervangen gen zijn functioneel. Het gedetailleerde stapsgewijze protocol hier gepresenteerd voor het genereren van een binaire transcriptionele stuurprogramma uitgedrukt in Drosophila fgf/branchless-epitheliale/neuronale cellen produceren voor elke gen – of weefsel-specifieke expressie kan worden aangenomen.
Introduction
De genetische toolbox voor gerichte genexpressie is in Drosophila, waardoor het een van de beste modelsystemen te onderzoeken van de functie van genen die betrokken zijn in een breed scala van cellulaire processen goed ontwikkeld. Binaire expressiesystemen, zoals gist Gal4/UAS (upstream activering sequence), werd aangenomen voor weefsel-specifieke enhancer overlapping en gene misexpression in de Drosophila genetische model1 (Figuur 1). Dit systeem vergemakkelijkt de ontwikkeling van een groot aantal technieken zoals Spatio verordening overexpressie van het gen, misexpression, knock-out in geselecteerde groepen cellen zo goed zoals in cel ablatie, cel markering, live traceren van cellulaire en moleculaire processen in het embryo en weefsels, lineage tracering en mozaïek analyses tijdens de ontwikkeling. Een aantal binaire transcriptie systeem, zoals de bacteriële LexA/LexAop systeem (Figuur 1) en Neurospora Q-systeem, zijn krachtige genetische hulpmiddelen die worden nu algemeen gebruikt in Drosophila, in aanvulling op het oorspronkelijke Gal4/UAS systeem voor gerichte gene expression1,2,3.
Hier presenteren we een methode voor het genereren van zeer betrouwbare weefsel toepassingsspecifieke binaire expressie systemen door gebruik te maken van een genoom-bewerken-techniek. De recente vooruitgang in CRISPR/Cas9 genoom bewerken technologie hebben toegestaan ongekende mogelijkheden gestuurde genoom wijzigingen aanbrengen in een brede waaier van organismen. In vergelijking met de andere beschikbare genoom-bewerkingstechnieken, is het CRISPR/Cas9-systeem goedkoop, efficiënt en betrouwbaar. Deze technologie maakt gebruik van onderdelen van het bacteriële adaptieve immuunsysteem: een Cas9 endonuclease van Streptococcus pyogenes die creëert een dubbel-strand break (DSB), en een chimeer gids-RNA (gRNA), die de Cas9 aan een bepaalde genoom site voor gidsen gerichte DSB4. De cellen bevatten de machine om te herstellen van de DSB met verschillende routes. Non-homologe einde deelname aan (NHEJ) leidt tot kleine invoegingen of verwijderingen verstoren genfunctie, terwijl homologie geleide reparatie (HDR) een gedefinieerde regie/wenselijk genomic knock-in/knock-out introduceert met behulp van een exogene HDR donor als een sjabloon. De vervanging HDR gebaseerde strategie kan efficiënt worden gebruikt voor het genereren van een zeer betrouwbare weefsel toepassingsspecifieke binaire expressie-systeem, dat alle beperkingen van de traditionele enhancer val methoden kan overwinnen. We beschrijven een stapsgewijze procedure voor het gebruik van CRISPR/Cas9 gebaseerde HDR reparatie bij het genereren van een binaire transcriptie driver regel die onder de controle van endogene verordening op het gebied van transcriptionele en post-transcriptional van een Drosophila wordt uitgedrukt gen. In dit protocol, tonen we de generatie van een driver regel specifiek voor branchless (bnl) gen een FGF familie eiwit dat vertakkende morfogenese van tracheale airway epitheel5 regeltcodering. In dit voorbeeld wordt de eerste codering exon van de bnl -gen werd vervangen door een opeenvolging van een bacteriële LexA transactivator reeks zonder te veranderen van een endogene cis-regulerende sequenties van de bnl -gen. We laten zien dat de strategie een bnl-LexA driver regel die spatiotemporally de expressie van een gen van de verslaggever geplaatst stroomafwaarts van LexAoperator (LexAop of LexO) uitsluitend in bnl regelt- gegenereerd epitheliale/mesenchymale/neuronale cellen uiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Traditioneel, werden Drosophila enhancer vallen gegenereerd door twee verschillende methoden. Een van de manieren bevat willekeurige invoeging van een stuurprogramma (bijv., Gal4) volgorde in het genoom door omzetting (bv., P-element omzetting)1 . Als alternatief, kunnen de stuurprogramma-sequenties worden geplaatst onder de Transcriptionele controle van een vermeende versterker/promotor regio in een plasmide constructie, die vervolgens zou worden geïntegreerd in een ec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. F. Port, Dr. K. O’Connor-Giles en Dr. S. Feng voor discussies over de strategie van de CRISPR; Dr. T.B. Kornberg, en het Bloomington voorraad Center for reagentia; UMD imaging core faciliteit; en financiering van NIH: R00HL114867 en R35GM124878 naar SR.
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Biologia Molecolare |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Biologia Molecolare |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Biologia Molecolare |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Biologia Molecolare |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Biologia Molecolare |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Biologia Molecolare |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Biologia Molecolare |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Biologia Molecolare |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Biologia Molecolare |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Biologia Molecolare |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Biologia Molecolare | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Biologia Molecolare |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Biologia Molecolare |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
Riferimenti
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lai, S. -. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Biologia dello sviluppo. 427 (1), 35-48 (2017).
- Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O’Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).
- Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), 657-664 (2013).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetica. 186 (2), 735-755 (2010).
- Lin, C. -. C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetica. 203 (4), 1613-1628 (2016).
- Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).
